اسم المؤلف:
الهام كاظم ناصر
اسم المشرف:
غياث حميد مجيد
المستخلص:
عزلت 12عزلة تابعة لجنس Bacillus من عينات شملت التربة والجبن والقيمر واللبن الرائب المجفف واللبن الرائب الناشف والحنطة. شخصت العزلات حسب الصفات المظهرية والفحوصات الكيموحيوية ، واوضحت النتائج انها تعود الى انواع من بكتريا Bacillus وهي ثلاث عزلات By0 Br3 , Bs0 , تمثل Bacillus cereus، وثلاث عزلات Bc1 , Bc3 , Br4 تمثل Bacillus sublilis والعزلات Bc2 , Bw0 كانت تمثل Bacillus coagulans، اما العزلة Br1 فقد كانت B.megaterium والعزلة Br2 كانت B.alvei، فيما كانت العزلة By1 B.licheniformis . اوضحت نتائج الغربلة الاولية بان العزلة Bc3 كانت الاكفا في انتاج انزيم الكولسترول اوكسديز COB. كانت الظروف المثلى لانتاج انزيم COB من العزلة المحلية Bc3 كما يلي : - 2% سكر الكلوكوز مصدر كاربوني. - 0,15 كبريتات الامونيوم مصدر نتروجيني. - 7 الدالة الحامضية الابتدائية. - 35م درجة الحرارة لحضن وسط الانتاج . - 1,75مل حجم لقاح وبمعدل 3,5% - 150 هزة/دقيقة سرعة الحاضنة الهزازة. - 0,2% تركيز كولسترول لانتاج الانزيم - 24 ساعة مدة الحضن. تمت تنقية الانزيم وفق خطوات التنقية والتي تضمنت الترسيب بكبريتات الامونيوم وبنسبة اشباع 70% اذ بلغت الفعالية الانزيمية 16,66وحدة/مل وبفعالية نوعية 111,07وحدة/ملغم بروتين واستكملت التنقية بالترشيح الهلامي باستعمال العمود سيفادكس G - 100 اذ ظهرت اربع قمم بروتينية وكانت القمة الرابعة ذات فعالية انزيمية 6,5 وحدة/مل، وبفعالية نوعية 162,5وحدة/ملغم بروتين وكانت عدد مرات التنقية 4,31 وبحصيلة انزيمية مقدارها 1,4%. وللتاكد من نقاوة الانزيم اجري الترحيل الكهربائي واوضحت النتائج ظهور حزمة بروتينية واحدة في هلام متعدد الاكريل امايد. درست صفات الانزيم المنقى فقد قدر الوزن الجزيئي لانزيم الكولسترول الاوكسديز المنتج من العزلة Bc3 بتقنية الترحيل الكهربائي في هلام متعدد الاكريل امايد وبوجود SDS وكان 60 كيلو دالتون. وبينت النتائج ان الدالة الحامضية المثلى لفعالية الانزيم المنقى هي 7 اذ اعطى الانزيم اعلى فعالية انزيمية مقدارها 80 وحدة/مل. وبلغت الدرجة الحرارية المثلى لفعالية الانزيم المنقى 50 م وبفعالية انزيمية 106,72 وحدة/مل. اما الدالة الحامضية المثلى لثبات الانزيم فقد تراوحت بين 6 - 9 فقد احتفظ الانزيم لكامل فعاليته عند هذا المدى للدوال الحامضية. وكان الثبات الحراري للانزيم عند مدى حراري تراوح بين 40 - 60م .درست الثوابت الحركية للانزيم واوضحت النتائج ان قيم ثابت ميكالس Km للانزيم بلغت 14,2 مايكرومول وبلغت السرعة القصوى Vmax 0,03 مايكرومول/دقيقة. اثبتت النتائج قابلية الانزيم العالية على خفض الكولسترول في الحليب فقد انخفضت نسبة الكولسترول الى 3,577 ملغم/100مل مقارنة مع 15,035 ملغم/100مل للحليب غير المعامل بالانزيم. استعمل الانزيم في صناعة اللبن الرائب لدراسة مدى امكانيته في خفض الكولسترول في المنتوج النهائي. اوضحت النتائج قابلية الانزيم العالية في خفض الكولسترول في اللبن الرائب حيث انخفضت نسبة الكولسترول من 16,648 في الحليب المعد في الصناعة الى 3,013 ملغم/100 مل باستخدام 0,25 وحدة/مل من الانزيم . لم تختلف درجات التقييم الحسي اللبن الرائب المصنع من الحليب المسترجع والذي اضيف اليه الانزيم بتركيز 0,25 وحدة/100مل حليب عن معاملة السيطرة فيما يتعلق بالصفات الحسية والتي شملت النكهة واللون والقوام. | Twelve strains that belonged to the genus Bacillus were isolated from different sources which are : soil, cheese, thick cream (Gaimer), dry yoghurt (Jameed), concentrated yoghurt (Laban Nashif), myonaise, and wheat.The isolates were identified according to their morphological characteristics and biochemical tests. The results showed that all isolates belonged to Bacillus species which were classified to : Three isolate (By0, Br3 and Bs0) as Bacillus cereus. Four isolates (Bc1, Bc3 and Br4) as Bacillus subtilis. Two isolates (Bc2 and Bw0) as Bacillus coagulans. One isolate (Br1) as Bacillus megaterium. One isolate (Br2) as Bacillus alvei. One isolate (By1) as Bacillus licheniformis. Primary screening results showed that the isolate Bc3 was the best in producing the enzyme cholesterol oxidase (COB).Optimum conditions for producing COB from Bc3 were studied, the optimum values obtained are shown below : - Carbon source : 2% glucose. - Nitrogen source : 0.15% ammonium sulfate. - pH value : 7 - Temperature : 35C° - Inoculum : 3.5% - Shaking speed : 150 shake/min - Incubation period : 24 hrs. - Concentration of Cholesterol : 0.2%.Purification of COB were accomplished as follow : - Ammonium sulfate precipitation (70% saturaqtion). - Gel filtration through sephadex G - 100.Enzyme activity obtained after ammonium sulfate precipitation was 16.66 unit/ml and the specific activity was 111.07 unit/mg. Four peaks were resulted from gel filtration step. The fourth peak was found to contain COB. Activity of COB in the pooled tubes was 6.5 unit/ml and the specific activity was 162 unit/mg, with a recovery of 4.31 and a yield of 1.4%.Poly acrylamide gel electrophoresis (PAGE) of the purified COB was conducted to check the purity. One band was noticed which revealed that COB is pure. The molecular weight of COB was estimated by means of SDS - PAGE technique, which was found to be 60 K Dalton. At pH 7 the highest activity of COB was obtained which was 80 unit/ml. This pH value was considered as the optimum pH of the enzyme. However, at a temperature of 50 C and pH 7, the highest activity was gained which was 106.72 unit/ml, therefore, this temperature is regarded as the optimum for COB reaction. COB stability at different pH values showed that the enzyme is stable at a range of 6 - 9. Heat stability of COB when incubated at a temperature range 0 - 80 C for 1 hr showed that the enzyme is stable at 60 C, then started to decrease till it reached at 40 - 60 Cº.Maechalis - Menton constant (Km) and Maximum velocity (Vmax) of COB was found to be 14.2 µ mole and 0.03 µ mole/mint, respectively.An experiment was conducted to examine the ability of COB obtained in this study in degrading cholesterol in milk and yoghurt. The results revealed that COB was efficient to degrade cholesterol in both products under the experiment conditions.Results showed that the enzyme was efficient to degrade cholesterol in milk. Cholesterol level decreased from 155.34 mg/100 ml milk to 35.77 mg/100ml. The enzyme was used to detect its ability in reducing cholesterol content in yoghurt. Results revealed that the enzyme was able to reduce cholesterol percentage from 150.84% in milk to 30.13% in yoghurt when used in amount of unit/100 ml milk. Sensor evaluation of yoghurt for both enzyme treated and non - treated milk had no significant differences. However, yoghurt with added COB got higher degrees than control.
