Author name:
سارة عقيل حسن التميمي
Supervisor name:
هدى هادي الحسناوي
Abstract:
اجريت هذه الدراسة للكشف عن التاثيرالمايكروبي المضاد لدقائق الفضة النانوية ضد بكتريا الزوائف الزنجارية المعزولة من عينات سريرية, تم جمع 100 عينة من مصادر سريرية مختلفة, تضمنت العينات السريرية عينات الحروق , والادرار, والدم, واصابات الاذن, والقشع تم اخذ هذه العينات من المرضى الراقدين في مستشفى الحلة التعليمي خلال الفترة من تشرين الثاني 2016 الى كانون الثاني 2017. زرعت جميع العينات على وسط السترمايد, وسط اكار الدم, وحضنت كل الاطباق هوائيا بدرجة حرارة C°37 لمدة 18ساعة. تم تشخيص بكتريا الزوائف الزنجارية بالاعتماد على الصفات المظهرية والكيموحيوية.كان توزيع العزلات كالاتي : 22(52.4%) من عينات الحروق, 8(19%) من عينات الادرار, 14.3)6%) عينة من المرضى المصابين بالالتهاب الاذن الخارجية, 4(9.5%) من عينات الدم,2(4.7%) من عينات القشع. اظهرت نتائج اختبار الحساسية باستخدام طريقة الانتشار في الوسط ان جميع العزلات(26) كانت مقاومة لكل من الببراسلين (100%), السيفوتاكسيم (100%),بينما نسبة المقاومة لكل من الاميكاسين (88%), سيفترياكسون (65%), جنتامايسن (62%), بينما وجدت نسبة مقاومة قليلة للسفتازديم (15%), وكل العزلات كانت حساسة (100) لكل من الميروبينيم, اوفلوكساسين, نورفلوكساسين والسبروفلوكساسين. تم في هذه الدراسة ايضا الكشف عن تكوين الاغشية الحيوية بواسطة طريقتين : طريقة الطبق الزرعي النسيجي (TCP) وطريقة صبغة الكونكو الحمراء (CRA) فكانت النتائج كالاتي : وجد ان في طريقة الطبق الزرعي النسيجي كانت جميع عزلات الزوائف الزنجارية والبالغ عددها (9) منتجة للاغشية الحيوية, (4) من اصل (9) (44%) من عزلات الزوائف الزنجارية انتجت مستعمرات سوداء بواسطة طريقة صبغة الكونكو الحمراء. وكذالك في هذه الدراسة تم الكشف عن تاثير جزيئات الفضة النانوية ((AgNPs على تكوين الاغشية الحيوية باستخدام تراكيز مختلفة (µg/ml 2.5, µg/ml 5, 10 µg/ml, 20µg/ml),حيث اظهرت النتائج ان اعلى فعالية لجزيئات الفضة النانوية كانت عند التركيز (20) وبنسبة تثبيط (100%), من جهة اخرى تم اختبار التاثير البكتيري المضاد لجزيئات الفضة النانوية ضد مختلف انواع العزلات البكتيرية باستخدام طريق التخافيف في الوسط الصلب وتراكيز مختلفة من جزيئات الفضة النانوية (12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, (100 µg/ml, 200 µg/ml وكانت العزلات كالتالي : ـ(S. aureus, E. coli, E. cloacae, K. pneumonia, P. aeuroginosa)اظهرت النتائج ان اعلى فعالية لجزيئات الفضة النانوية كانت عند التراكيز(100 µg/ml, 200 µg/ml).ايضا تم تعريض ظاهرة السوارمنك في عزلات الزوائف الزنجارية لتراكيز مختلفة من جزيئات الفضة النانوية (2.5 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml ), ووجد ان اعلى نشاط لجزيئات الفضة النانوية ضد ضاهرة السوارمنك وانتاج البايوسيانين كانت بتركيز ((10 µg/ml, 5 µg/ml .تم زراعة جميع عزلات بكتريا الزوائف الزنجارية (26)عزلة بوجود نترات الفضة (AgNO3) بتراكيز تتراوح (100 µg/ml - 400 µg/ml ) باستخدام طريقة التخافيف في الوسط الصلب مع قدرات مختلفة لانتاج البيوسيانين. اظهرت النتائج ان جميع العزلات 26((100 المنتجة للبايوسيانين كانت مقاومة للسلفر نايتريت (AgNO3) من خلال ظهور نمو في الطبق الحاوي على التراكيز المذكورة نترات الفضة (AgNO3).في هذه الدراسة تم اختبار بكتريا الزوائف الزنجارية لانتاج البكتريوسين باستخدام عزلات بكترية مختلفة تضمنت العزلات (امعائية مذرقية,مكورات العنقودية الذهبية,اشريكية قولونية, كلبسيلة رئوية). كذلك تم العثور على مجموعة واسعة من منطقة تثبيط (24mm - 30mm) في الانواع البكتيرية اعلاه مع قطر (30mm, 28mm, 24mm, 30mm) على التوالي. عزلات (امعائية مذرقية, كلبسيلة رئوية) كانت الاكثر تاثر والتي انتجت قطر تثبيط ((30mm. في هذه الدراسة ايضا تم تقييم علاقة مقاومة الفضة مع انتاج بيوسيانين في بكتريا الزوائف الزنجارية متعددة المقاومة للمضادات الحيوية. في هذه الدراسة تم استخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل للتاكد من وجود بعض الجينات. في هذه التقنية، تم فحص جينات bla - IMP)) التي تشفر الى انزيم ميتالو - β - لاكتاميز المسؤول عن مقاومة ايميبينيم وجينات (silS ,silE) التي تشفر لمقاومة الفضة في عزلات بكتريا الزوائف الزنجارية بواسطة استخدام برايمرت خاصة. وقد وجد ان جميع العزلات ال 26 (100%) من بكتريا الزوائف الزنجارية كانت سلبية لهذه الجينات. كما تم استخدام اثنين من البرايمرات المحددة للكشف عن فينازين (بيوسيانين) (phzS, phzM). اظهرت النتائج لل (phzM) ان من اصل 26)) عزلة , 21 (80.8%) اعطت نتيجة ايجابية, , فيما يخص (phzS gene) وجد ان 14(% 53.9) عزلة كانت حامله لهذا الجين . والخاتمة ان جزيئات الفضة النانوية (AgNps) تمتلك تاثير ضد الاغشية الحيوية وايضا لها تاثير بكتيري مضاد ضد بكتريا الزوائف الزنجارية وانواع بكتيرية اخرى, والتي من الممكن استخدامها كعلاج بديل. فيما يخص انتاج البايوسيانين ومقاومة الفضة، ظاهريا كان هناك تاثير البايوسيانين على مقاومة الفضة ولم تكن مقاومة الفضة بسبب نقل وجود جينات (silS, silE). | This study was conducted to detect the antimicrobial effect of silver nanoparticles (AgNPs) against Pseudomonas aeruginosa isolated from clinical samples, total of 100 specimens were collected from different clinical sites included urine, burns, ear, blood , and sputum. The specimens were taken from patients admitted to Al - Hilla Teaching Hospital during a period extended from November 2016 to January 2017. All specimens were cultured on selective medium (cetrimide agar), blood agar, then incubated at 37°C for 18 hr. The isolated of P. aeurginosa were diagnosed depending on morphological and biochemical characteristics.The distribution of P. aeurginosa isolates was as follows : 22(52.4%) isolates from burns, 8(19%) isolates from urine, 6(14.3%) isolates from patients with otitis externa, 4(9.5%) isolates were isolated from blood and 2(4.7%) isolates from sputum. Antibiotic susceptibility test using disc diffusion test revealed that all isolates (26) were resistant (100%) to Piperacillin, Cefotaxime. While the resistance rate for Amikacin (88%), Ceftriaxone (65%), Gentamicin (62%), but low resistance rate was found to Ceftazidime (15%) and all isolates were sensitive (100%) to Meropenem, Ofloxacin, Norfloxacin and Ciprofloxacin. The biofilm formation in P. aeurginosa isolates was investigated by two methods include, tissue culture plates method (TCP) and congo red agar method (CRA). The results showed that all isolates 9 (100%) were found to be biofilm producer when investigated by TCP assay, and 4 out of 9 (44. %) isolates of P. aeurginosa were producing black colonies when detected by CRA method.The effect of AgNps on biofilm formation was tested by using different concentrations of silver nanoparticles (2.5 μg/ml, 5 μg/ml,10 μg/ml, 20μg/ml). The results showed that the highest activity was at a concentration of 20 μg/ml, with an inhibition rate of 100%. On the other hand the antibacterial activity of AgNps was tested against different bacterial species isolates (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomnas aeurginosa) using agar dilution method with different concentrations of silver nanoparticles (12.5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml). The results showed that the highest activity was at a concentration of (100 μg/ml and 200μg/ml). On the other hand Swarming motility in P. aeruginosa isolates was detected and subjected to different concentrations of (AgNps) (2.5 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml), it was found that the highest activity of AgNps against swarming motility and pyocyanin production of P. aeurginosa was at a concentration of (5 µg/ml, and 10μg/ml).The relation of silver resistance with pyocyanin production in P. aeruginosa was assessed. Screening test for silver resistance was performed by agar dilution method, all (26 isolates) of P. aeruginosa were cultivated in the presence of AgNo3 at a concentration (100 µg/ml - 200 µg/ml, 400µg/ml) using agar dilution method with differing capacities for pyocyanin production. All isolates of P. aeurginosa 26(100%) that produce pyocyanin were found to be resistant to AgNo3.In this study P. aeruginosa isolates were tested for bacteriocin activity by the agar well diffusion method using different bacterial isolates : E. coli, K. pneumoniae, S. aureus, E. cloacae. Wide range of inhibition zone (24mm - 30mm) was found against above bacterial species with diameter (28mm, 30mm, 24mm, 30mm), respectively. The most affected bacteria were K. pneumoniae and E. cloacae isolates, which produce inhibition zone (30)mm.PCR technique was used in this study for investigation some genes. In this technique, blaIMP gene that encode Metallo - β - lactamase enzyme responsible for imipenem resistance and (silE and silS) genes that encoding silver resistance were investigated in P. aeuroginosa isolates by using specific primers. It was found that all 26 (100%) isolates of P. aeuroginosa were negative for these genes. Also two specific primers were used to detect phenazine (pyocyanin) modifying genes (phzM, phzS). According to phzM gene, it was found that out of 26 P. aeuroginosa isolates, 21 (80.8%) isolates gave positive results at 330 bp, in regard to phzS gene, it was found out of 26 P. aeurginosa isolates, 14 (53.9%) isolates gave positive result at 664 bp.In conclusion AgNps have an antibiofilm, antibacterial activity against P. aeruginosa and different bacterial species that could be used as an alternative therapy. In regard to pyocyanin production and silver resistance, phenotypically there was effect of pyocyanin pigment on silver resistance and the silver resistance was not due to carriage of silE, silS genes.
