Share
دراسة جزيئية وبكتريولوجية لبكتريا Bacteroides fragilis المعزولة من النساء المصابات بالتهاب المهبل البكتيري == Molecular and Bacteriological Study of Bacteroides fragilis Isolated from Women with Bacterial Vaginosis
Author name:
زهراء قيس سلمان
Supervisor name:
الهام عباس بنيان الساعدي | بشرى جابر عمران
General topic:
Medicine
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
University of Babylon - Faculty Of Medicine
Language:
English
University location:
Babylon
First pages:
19T1262 - p.pdf
Abstract:
شملت هذه الدراسة 150 مريضة يعانين من التهاب المهبل البكتيري ، تم جمع ما مجموعه 300 مسحة من عنق الرحم وافرازات مهبلية من هؤلاء المريضات بمعدل مسحتين اثنتين لكل مريضة و150 عينة دم جديدة تم جمعها من المريضات عند مراجعتهن الى مستشفيين في محافظة بابل هما : مستشفى بابل للنسائية والاطفال التعليمي ، ومستشفى الحلة التعليمي العام، و150 عينة دم جديدة كمجموعة سيطرة ، خلال الفترة من شباط الى تشرين الاول 2016. باستخام معايير امسلز تم تشخيص النساء اللواتي يعانين من التهاب المهبل البكتيري. وقد خضعت المسحات لطرق مختلفة لتحديد B.fragilis باستخدام الاساليب البكتريولوجية التقليدية. وجد ان 31 عزلة موجبة (20.6٪) باستخدام الاوساط الانتقائية. فضلا عن ذلك، تم تطبيق طرق الكشف الجزيئي باستخدام المعلم الوراثي المستند على دور جين 16 sRNA ، وكانت 44 عزلة (29.33٪) ايجابية وتعود لبكتريا B.fragilis وكذلك استخدم المعلم الوراثي nanH حيث كانت 39 عزلة (88.6٪) ايجابية. بالاضافة الى ذلك، تم فحص العزلات المعزولة على الاوساط الانتقائية الخاصة بالبكتريا للكشف عن قابلية البكتريا للالتصاق (adherence ability) بالخلايا المخاطية. كما تم التحري المظهري عن عملية تكوين الاغشية الحيوية (Biofilm formation) للعزلات المدروسة باستخدام فحص tissue culture plate (TCP) test اذ كانت مكونة للاغشية بنسبة (100%). حيث اظهرت العزلات 31 الموجبة المستخرجة من الوسط الانتقائي قدرة البكترياعلى تكوين ال Biofilm وكانت نسبة تكوين البيوفيلم (83.9٪) و(16.1٪) للوضع العالي والمعتدل على التوالي، في حين لم تكن هناك عزلات غير قادرة على تشكيل بيوفيلم. اما فيما يتعلق بتاثير بوفيدون - اليود بنسبة 10٪ على تكوين البيوفيلم، فقد اظهرت نتائج هذه الدراسة ان قدرة البكتريا على تكوينه قد تقلصت لتكون نسبة التشكيل قوي (6.5٪ (ومعتدل (71٪) و(22.6٪) لم يظهر اي تشكيل للبيوفيلم . تم فحص تاثير 10% povidone - iodine المستخدمة في الطب النسائي على انتاج الاغشية الحيوية . وقيمت الدراسة قابلية B.fragilis على انتاج bacteriocin وتاثيرها على بعض العزلات البكتيرية. اظهرت النتائج ان لعزلات البكتريا قدرة تازرية لتثبيط نمو العزلات المدروسة بنسب. فضلا عن ذلك، هدفت هذه الدراسة الى التعرف على علاقة التغايرالجيني(TLR - 4 Polymorphism) باستخدام تقنية البلمرة والقطع بالانزيم (PCR - RFLP) .وتبين من النتائج وجود ثلاث انماط جينية وكانت نسب انتشارها في مجموعة المرضى CC(36.0%) وThr399Ile : CT(12.0%) ,TT(52%) بينما نسب انتشارها في مجموعة السيطرة كانت TT(34.0%) , CC(60.0%) and CT(6.0%) وقد اظهرت وجود اختلاف وهو اختلافا معنويا, فيما بلغت نسبة انتشار الاليل T في المرضى (58%) بالمقارنة للسيطرة (37%) مع وجود اختلاف معنوي .وفي المقابل سجل وجود ثلاث انماط جينية في موقع طفرة Asp299Gly : AA(46.0%) ,GG(50.0%) and GA(4.0%) في مجموعة المريضات بينما في مجموعة السيطرة كانت نسب الانتشار AA(34.7%) , GG(59.3%) and GA(6.0%) مع عدم وجود فارق معنوي بينهما , اما نسبة انتشار الاليل G (52%) في مجموعة المريضات بالمقارنة بمجموعة السيطرة (62%) ويعد فارقا معنويا بينهما . تناولت الدراسة تحليل تسلسل جينات معينة من عزلات B.fragilis وكشفت نتائج التحليل للاحماض الامينية لجين Enterotoxin حيث تم تحديدها في 117/117 (100٪ (بمقارنة تسلسلها مع تلك التي في قاعدة البيانات في بنك الجينات وكانت نسبة الثغرات بينهما (0)٪ ، اما بالنسبة للعزلة الثانية فقد تم التعرف على نتائج التحليل للاحماض الامينية لجين Enterotoxin في 116/116 (100٪) وبثغرات 0/116 (0٪)، اما بالنسبة لجين Phospholipaseتم تحديدها في 129/129 (100٪) مع ثغرات 0/1129 (0٪) لكل من العزلتين . اخيرا تم تحليل العلاقات التطورية بين العزلات محلية من B.fragilis والعزلات العالمية من B.fragilis باستخدام تسلسل الجينات لل Enterotoxin وPhospholipaseحيث اظهر تحليل تسلسل الحمض النووي لجين Enterotoxin ان عزلات B.fragilis المحلية (NO.1) و(No.2) كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا بعزلة B. fragilis المسجلة عالميا (AB026625.1) و(U67735.1) ونسبة التغير الجيني الكلي في شجرة التطور (0.01%) في حين ان نتائج تحليل النشوء والتطور من تسلسل جينات Phospholipase كشفت ان نفس العزلات المحلية (NO.1) و(No.2) كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا بالعزلة المسجلة عالميا (CP011073.1) ، ونسبة التغير الجيني الكلي في شجرة التطور كانت (0.003 - 0.005%). | This study included 150 women with bacterial vaginosis (BV), a total of 300 swabs (as two high vaginal swabs for each woman and vaginal discharge ) were taken from each woman. In addition to fresh blood samples were collected from the same 150 women with bacterial vaginosis and 150 healthy women as control group , these women admitted to the out - patient clinics of Gynecology and Obstetrics , in two hospitals of Babylon Province : Babylon Maternity and Pediatrics Teaching Hospital, and Al - Hillah General Teaching Hospital during the period from February until October 2016. Women suffering from bacterial vaginosis were diagnosed according to Amsels criteria .The high vaginal swabs were subjected to different methods for identification of Bacteroides fragilis by using traditional bacteriological methods . It was found that 31(20.6%) isolates were recovered by using selective media . Furthermore , molecular detection methods was applied by using 16s rRNA gene ,where 44(29.33%) isolates were positive , and using nanH gene where 39(88.6%) isolates were positive out of the 44 isolates , these genetic markers were used for confirmation detection of B.fradilis isolates . In addition , the 31 isolates recovered from selective media were investigated to detect adherence of B.fragilis to mucosal epithelia cells .Also , biofilm formation was tested in semi quantitative microtiter plate test . The result revealed that all isolates were biofilm former , biofilm formation were accounted (83.9%) and (16.1%) for high and moderate mode respectively , while there were no isolates that do not express biofilm formation . Regarding on effect of 10% povidone - iodine on biofilm formation ,the result of this study demonstrated that internal douche effectively reduced the viability of biofilm forming to strong (6.5%) , moderate (71%) and (22.6%) shown no biofilm formation . The study was also evaluated the susceptibility of bacteriocin produced by B.fragilis on some isolates of bacteria . The result revealed that B.fragilis have synergistic ability to inhibition the growth of studied isolates with different ratios . Additionally, this study aimed to investigate the relation of Asp299Gly and Thr399Ile Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) in the Toll - like receptor - 4 (TLR - 4) with the incidence of bacterial vaginosis .The result elucidated that at the site of Thr399Ile SNP, there were three genotypes for this SNP among patients ; TT,CC and TC with frequency of (52%) ,(36.0%) and (12.0%) respectively , whereas , the genotype frequency among control group were TT(34%) ,CC(60%) and TC(6.0%) with significance differences between patients and control . However, the frequency of allele T (mutant) was higher among patients (58%) than control (37%) with significant difference. The site of Asp299Gly SNP also showed three genotype among patients with frequency of AA(46.0%), GG(50.0%) and GA(4.0%) , whereas the genotype frequency among control group were AA(34.7%) , GG(59.3%) and GA(6.0%) with no significant differences between patients and control . Additionally , the frequency of allele G(mutant) was higher among control(62%) than patients (52%) with significant differences between them . The study deal with sequence analysis of specific genes of B.fragilis isolates revealed that the analysis results of amino acids for enterotoxin gene was identified in 117/117(100%) by comparing its sequence with that in the database in gene bank by Blast program with gaps 0/117(0%) and for the second isolate the analysis results of amino acids for enterotoxin gene was identified in 116/116(100%) and with gaps 0/116(0%) , while for phospholipase gene was identified in 129/129(100%) with gaps 0/1129(0%) for first isolates.Finally ,the phylogenetic relationships between two local isolates of Bacteroides fragilis and Bacteroides fragilis global isolates were analyzed using the enterotoxin and phospholipase genes sequence. The DNA sequencing analysis of enterotoxin gene revealed that B. fragilis local number (No.1and No.2) isolates were closely related to isolation B. fragilis recorded globally NCBI - BLAST B. fragilis (AB026625.1) and (U67735.1) , whereas other NCBI - Blast B.fragilis enterotoxin gene were show different out of tree at total genetic change (0.01%) , while the phylogenetic analysis results of phospholipase gene sequences revealed that B. fragilis local isolates ( No.1and No.2) were closely related to isolation B. fragilis recorded globally NCBI - BLAST B. fragilis (CP011073.1) , whereas other NCBI - Blast B.fragilis phospholipase gene showed difference out of tree at total genetic change (0.003 - 0.005 %).
