Author name: محمد حسن عبد الكاظم الكعبي

Supervisor name: الهام سعيد عبد الكريم

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

University: University of Baghdad

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: This study isolation and Identification of Esherichia coli in Babylon province. Atotal of 206 samples were obtamel which Include 86 stool sample from patients with diarrhea for both sexy and different ages in AL - kasem and AL - Hashimia hospitals from 2 - 2 - 2015 to 30 - 3 - 2015.60 samples of ground beef meat and 60 samples of Localy raw cheeses were obtamil from Hlla , Kasem, Hashimia and Hamza states form the period from 4 - 2 - 2015 to 17 - 4 - 2015 .2. 145 Isolates characterrizd as E.coli depending on the characteristics of the colonies phenotypic and microscopic when grown in diffrerential selective media as well as biochemical test to diagnose Isolates .Then the Identification of these species were confirmal by using Api20E system . 77(89.53 %) E.coli Isolates were obtamel from stoolsamples ,33(22.75%) from ground beef meat , samples 35(24.14%) from Localy raw cheeses samples.3. Serological Identification for 145 E.coli Isolates showed that 31 Isolates (21.8%) were belonged to O157 : H7 ,also results showed 69 E.coli Isolates (47.58%)were belonged to polyvalent II (O111,O119,O26,O55,O126) ,22(15.17%) belonged to polyvalent III (O86,O114,O123,O127,O128),11(7.59%) Isolates belonged to polyvalent IV (O112,O124,O142), 2 Isolstes .belonged to O128 Monovalent serotype from stooland cheese samples and 2Isolates belonged to O159 Monovalent from stool samples .4. Results of Virulence factors of E.coli Isolates showed the ability of 66(45.51%)Producing hemolysin (α,β),E.coli Isolates showed containing tow types of adherence CFA/1 and CFA/III , and tow ratios were 104(71.72%) and 77(53.10%)Respectively ,109(75.7%) Isolates shwed ability to produce Biofilm and 122(84.15%) Isolates showed ability to produce β - Lactamase .5. The Antibiot snsceptibility to all E.coli O157 : H7 Isolate .were performed according to Kirby Bauer testing ,showed ahigh degree of resistance 100% to Ampicillin and Mmeropenem, All Isolates showed Susceptibility 0% to Impenem and Amikacin ,Norfloxcin 96.77% and Gentamycin 90.32%.while resistance to Ceftazidine, Pipracillin ,Ofloxacine and Trimethoprime 77.41%, 70.96 %70 .96%67 74% respectively .6. The molecular Investigation of the genes stx1,stx2 hlyA and flic : H7 was made by taking out the bacterial DNA of all E.coliO157 : H7.Isolates using polymerase chain reaction PCR techniques , results showed 26(83.87%)Isolates gene positive result for stx1 at (180 bp) ,9(29.03%) gave positive result for stx2 at(255bp),all Isolates 100% gave hlyA at (534bp),23(74.19%) gave positive result for flic : H7 at (625bp).

دراسة بعض الصفات الكيميائية والفيزيائية والبايولوجية للبكتريوسين المستخلص من بكتريا Bacillus spp. المعزولة من مصادر بيئية مختلفة == Study of some chemical, physical and biological properties of bacteriocin extracted from Bacillus spp. isolated from different ecosources

Author name: بشار قصي كاظم

Supervisor name: رشيد محجوب مصلح

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

Degree: Master

University: University of Baghdad

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تضمنت هذه الدراسة عزل وتشخيص عزلات لبكتريا Bacillus من التربة والماء والغذاء .عزلت 51 عزلة من 67 عينة منها كانت عائدة لبكتريا Bacillus spp. وفقط 17 عزلة منها كانت منتجة للبكتريوسين واختبرت فعالية البكتريوسين تجاه البكتريا الدالة Listeria monocytogenes , حيث اظهرت اختبارات التشخيص بان افضل العزلات المنتجة كانت Bacillus cereus Me1 المعزولة من اللحوم. حددت الظروف المثلى لانتاج Bacteriocin Me1 من العزلة المنتقاةBacillus cereus Me1 ولوحظ بان افضل الاوساط لانتاج Me1 Bacteriocin هو مرق نقيع القلب والدماغ المدعم با لكلوكوز بتركيز 0,1% وبحجم لقاح 2% والحاوي على 1.5×810 خلية /مليلتر ورقم هيدروجيني امثل 6.5 وبدرجة حرارة مثلى 30 م° بعد 18 ساعة حظن .نقي البكتريوسين المنتج من B.cereus Me1 بعدت خطوات تضمنت الترسيب بكبريتات الامونيوم وبنسب اشباع (30,50,60,70,80)% واظهرت النتائج بان افضل اشباع حصل عند80% من كبريتات الامونيا المستخدمة تبعتها طريقة كروموتوكرافيا التبادل الايوني باستخدام عمود DEAE - Sephadex وطريقة الترشيح الهلامي في عمود هلام السيفاكريل - .S200 والوزن الجزيئي له حدد بطريقةالترحيل الكهربائي في هلام SDS - PAGE واظهرت حزمة بروتينية مفصولة واحدة وكان وزنها الجزيئي 9100 دالتون. وباختبار تاثير قيم ال pH على فعالية البكتريوسين اظهرت بان الفعالية لم تتاثرفي pH بينما قلت الفعالية في pH اقل من 6 واعلى من 8 . البكتريوسين كان ثابت الفعالية عند المعاملة بالتسخين حتى 70 م° حيث انخفضت فعاليته عند درجات حرارة اعلى منها وفقدت كليا عند 121 م°. البكتريوسين B.cereus Me1 كان فعالا تجاه جميع البكتريا الموجبة لصبغة كرام المختبرة (Bacillus cereus وBacillus licheniformis وBacillus subtilisو (Staphylococcus aureus والفطر Candida albicansو Erwenia caratovora بينما كان غير فعالا تجاه البكتريا السالبة لصبغة كرام Pseudomonas aeroginusa ) وEscherichia coli. ) | This study involved the isolation and identification of the Bacillus isolates from soil, water and food samples. The results showed that 51 isolates from 67 samples were belonged to Bacillus spp. All isolates were tested and only 17 of them were bacteriocin producers. Bacteriocin activity was tested against Listeria monocytogenes (Bacterial indicator). Optimization the conditions for production of bacteriocin by B.cereus Me1 revealed that the best conditions for production were Brain Heart Infusion broth medium supplemented with 0.1% glucose , inoculums size 2% (1.5 x 108 cell/ml), pH 6.5 and incubation temperature 30 °C for 18 hrs.The purification of the bacteriocin from the B.cereus Me1 was carried out by ammonium sulfate precipitation in saturated percentages of (30, 50, 60, 70,80)% and The result showed that the best saturation was obtained at 80% ammonium sulfate. Two steps of purification was performed including ion exchange Chromatography by using DEAE - Sephadex and gel filteration by using Sephacryl - S200 . The purified Bacteriocin was named Bacteriocin Me1 according to the isolate Me1 for characterization of purified bacteriocin the molecular weight was determined with gel electrophorsis SDS - PAGE and one band of separated protein appeared. It is M.W was about 9100 Dalton. Testing the effect of pH values on bacteriocin activity it was stated that this activity didn't affect at pH 6, 7, 8, while this activity decreased at pH lower than 6 and higher than 8. The bacteriocin was stable with heating up to 70°C , higher than this the activity minimized and completely lost at 121°C. The B. cereus Me1 bacteriocin was active against all tested Gram - positive bacteria (Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus) and fungus C. albicans and Erwenia caratovora while was unactive against Gram negative bacteria ( Pseudomonas. aeruginosa and Escherichia coli

دراسة مقارنة بين العزلات المحلية لبكترياStaphylococcus epidermidis المقاومة والحساسة للمثيسلين == Comparative Study between Local Isolates of Methicillin Sensitive and Resistance of Staphylococcus epidermidis

Author name: استبرق نبيل عبد اللطيف

Supervisor name: مي طالب فليح

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

Degree: Master

University: University of Baghdad

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تم الحصول على 60 عزلة من المكورات العنقودية من 140 عينة سريريه (ادرار، مسحات اذن، مسحات انفية، جروح، عينات الدم). اثنان وثلاثون عزلة (53.3%) من العدد الكلي للمكورات العنقودية شخصت على انها عنقوديات غير مخثرة لذيفان مخثر بلازما الدمCONS)). تسعة عشر عزلة (59.38%) من CONS شملتStaphylococcus .epidermidis تم فحص الحساسية للعزلات المحلية من S. epidermid لمضاد المثيسلين, النتائج اظهرت 3عزلات من S. epidermidis حساسة للمثيسلين و16عزلة من S. epidermidis كانت مقاومة للمثيسلين، طبقا لهذه النتائج صنفت العزلات الى مجموعتين : - S. epidermidis مقاومة للمثيسلين MRSE)) وS. epidermidisحساسة للمثيسلين .(MSSE) اجري اختبار الحساسية لهاتين المجموعتين من S. epidermidis لاحد عشر مضادا حيويا، اظهرت النتائج مقاومة عالية ومتعددة ل MRSE لهذه المضادات بينما MSSE كانت عالية الحساسية، حيث اظهرت الMRSE حساسية 100% لمضاد vancomycinفقط. وتراوحت نسبة مقاومتها للمضادات penicillin G100% وclindamycin75% وamoxicillin 68.7% وamoxicillin clavulinic acid 68.7% وtetracyclin56.2% وrifampin 56.2% وcephalexin56.2% وerythromycin50% وciprofloxacin50% وgentamicin 43.7%. بينما اظهرتMSSE حساسية 100% لمضاد gentimicinو rifampin وclindamycin وciprofloxacin وvancomycinونسب مختلفة من المقاومة للمضادات الاخرى، اذ كانت نسبة مقاومة MSSE لمضاد amoxicillin وamoxicillin clavulinic acid وcephalexinو erythromycinو penicillin G و.%33 tetracyclin تم التحري عن انتاجية MSSEو MRSE لبعض عوامل الفوعة شملت الهيمولايسين والبروتييزواللايبيزواليورييزوالجيلاتينييزوانزيم المحلل للحامض النوويDNA اظهرت النتائج انMRSE تمتلك نسبة انتاجية لهذه عوامل الفوعة اعلى منMSSE . حيث ان نسبة انتاجية هيمولايسين، البروتييز، اللايبيز، اليورييز، الجيلاتينييز وانزيم المحلل للحامض النووي DNA فيMRSE كانت80%، 100%، 80%، 100%، 60%، و30% على التوالي، بينما كانت نسبة الانتاجية لهذه العوامل في MSSE 67%، 100%، 67%، 100%، 33% و33% على التوالي. تم تحديد التراكيز المثبطة الدنيا للمضادات penicillinو .tetracyclin اذ كانت قيم التراكيز المثبطة الدنيا للعزلة 32S هي 60 وحدة للبنسلين و25مايكروغرام/مل للتتراسايكلين، 40 وحدة للبنسيلين للعزلة .40S تم دراسة امراضية MRSE وMSSE باختبار سميتها باستخدام ذكور الفئران البيض السويسرية، وكانت الاعداد البكتيرية المستخدمة هي (108،109، 1010 ،1011 ،1012) cfu/ml والتي تم حقنها داخل بريتون الفئران. لم تسجل اي نسبة قتل بكل التراكيز المستخدمة ل MSSE بينما بلغت نسبة القتل 33% بالتراكيز1010 و11 10 cfu/ml لMRSE. درست التغيرات النسيجية في انسجة الكبد، الطحال، الكلى، الرئة والقلب لذكور الفئران المحقونة ب MSSE و.MRSE لوحظ ان التاثيرات النسيجية التي سببتها MRSE كانت اعلى من تلك التي سببتهاMSSE . اكثر الاعضاء تاثرا نتيجة حقنMSSE وMRSE هما الرئة والكلى واللتان سبتتا نسبة عالية من النخر بهذين العضوين وكان التاثير اقل في الطحال والكبد من الرئة والكلى، ولم يظهر اي تاثير في قلب الفار المحقون بMSSE لكن هناك بعض التاثيرات في قلب الفار المحقون بMRSE. اظهرت نتائج الترحيل الكهربائي لعزلتيMSSE ( 51S و(5Sبانها لا تمتلك اي بلازميد بينما عزلتانMRSE تمتلك بلازميدات، كما لوحظ وجود بلازميدان في عزلة 40S احداهما بلازميد كبير والاخر صغير في حين ان العزلة الاخرى من MRSE 32S تمتلك 3 بلازميدات واحد منها كبير واثنان صغيران. اظهرت نتائج تحييد البلازميد باستخدام SDSو Rifampin ان بلازميدات العزلتين 32S)، (40S قد حييدت عند المعاملة ب100مايكروغرام/مل، 230مايكروغرام/مل من SDSعلى التوالي، 150مايكروغرام/مل، 200مايكروغرام/مل من Rifampinعلى التوالي. اظهرت الخلايا المحييدة للعزلة 40S حساسية للبنسيلين وبقاء المقاومة للمثيسلين كما اظهرت الخلايا المحييدة للعزلة 32S حساسبة للبنسلين وتتراسايكلين واحتفاظ البكتريا بمقاومتها للمثيسلين. | Sixty isolates of Staphylococcus were obtained from one hundred forty clinical specimens (urine, ear swabs, nasal swab, wound, and blood). Thirty two isolates (53.3%) of total number of Staphylococcus were identified as coagulase - negative staphylococci (CONS), nineteen isolates(59.38%) of CONS were included Staphylococcus epidermidis. Sensitivity of local isolates of S. epidermidis was examined against methicillin, the results showed 3 isolates from S. epidermidis were sensitive to methicillin and 16 isolates from S. epidermidis were resistance to methicillin, according to these results the isolates were splits to two groups : - methicillin resistance S. epidermidis (MRSE) and methicillin sensitive S. epiderimidis (MSSE). The sensitivity test of these two groups against 11 different antibiotics was done, the results showed MRSE were highly resistance and multi resistance patterns to these antibiotics, while MSSE showed highly sensitive. In MSSE showed 100% sensitivity to gentimicin, rifampin, clindamycin, ciprofloxacin and vancomycin, and different percentage of resistance to other antibiotics. The resistance percentage of MRSE to pencillin G 100%, clindamycin 75%, amoxicillin 68.7%, amoxicillin clavulinic acid 68.7%, cephalexin 56.2%, rifampin 56.2%, tetracyclin 56.2%, erythromycin 50%, ciprofloxacin 50%, gentamicin 43.7%. the resistance percentage of MSSE to amoxicillin, amoxicillin clavulinic acid, cephalexin, erythromycin, penicillin G and tetracyclin were 33%. While in MRSE showed 100% sensitivity to vancomycin only. Some virulence factors of MRSE and MSSE were detected including the hemolysin, protease, lipase, urease, gelatinase and DNase the results showed MRSE have higher percentage to produce these virulence factors than MSSE. The production percentage of hemolysin, protases, lipase, urease, gelatinase and DNase in MRSE was 80%, 100%, 80%, 100%, 60% and 60% respectively, while in MSSE 67%, 100%, 67%, 100%, 33% and 33% respectively. The minimum inhibitory concentration of antibiotics (penicillin and tetracyclin) to S. epidermidis isolate had been determined. they were 60U and 25µg/ml respectively for the isolate 32S, they were 40U of penicillin for the isolate 40S. The pathogenicity of MRSE and MSSE was studied by testing its lethality by using white Swiss male mice, the bacterial numbers was used that is (108,109,1010,1011,1012) cfu/ml and was injected in mice. Died of injected mice was not recorded with any used concentration in MSSE but in MRSE 33.3% of injected mice was killed in concentration 1010 and 1011 CFU/ml. Histological changes in liver, spleen, kidney, lung and heart tissues of male mice which were injected with MRSE and MSSE were studied. The histological effect were produced by MRSE was higher than those produced by MSSE. The most effective of MRSE and MSSE in lung, kidney because appeared of high necrosis in these organs but in spleen, liver of mouse were less effected from lung and kidney, in heart of mouse injected with MSSE no effect was recorded while in MRSE some effect have been seen. Results from agarose gel electrophoresis showed two isolates of MSSE 5S and 51S don't have any plasmid while other two isolates of MRSE have plasmids, two plasmids found in S. epidermidis isolate (40S), one of them was large plasmid and the other was small plasmid and in S. epidermidis isolate (32S) contained three plasmids, one from these was large plasmid and the other two plasmids were small plasmids. The results of plasmid curing by using sodium dodecyl sulphate (SDS) and rifampin showed that the plasmids of the local isolates 32S and 40S was curred by treatment with 100μg/ml, 230μg/ml respectively from SDS and 150μg/ml, 200μg/ml respectively from rifampin. Cured cells from 40S isolate (MRSE) were sensitive to penicillin and still resistance to methicillin and the cured cells from 32S isolate were sensitive to penicillin, tetracycline and still resistance to methicillin

دراسة مقارنة للتاثيرات ضد المايكروبية والسمية الخلوية للبايوسيانين المنتج من النوع البري وطافرة بكتريا Pseudomonas aeruginosa المعزولة محليا == A comparative study on the antimicrobial and cytotoxic effects of pyocyanin produced by wild type and mutant of locally isolated Pseudomonas aeruginosa

Author name: حسام محمود حسن العماري

Supervisor name: هيفاء هادي حساني | عدوية عبد الله السعدي

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

Degree: Master

University: University of Baghdad

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: عزلت بكتريا Pseudomonas aeruginosa من مختلف العينات (قشع, حروق, جروح, اذن, خروج, عين, ادرار) وشكلت بكتيريا P.aeruginosa نسبة 32% من العدد الكلي للبكتيريا المعزولة, تم تشخيصها على اساس الاختبارات البكتريولوجية والكيموحيوية, %92 من العزلات الكلية تميزت بانتاجها الصبغة الزرقاء المخضرة(Pyocyanin) على وسط كنج A.تميزت عزلة واحدة فقط من بين 45 عزلة من العزلات المنتجة للبايوسيانين بانتاجها للصبغة, حيث انتجت2.8ملغم/مل , هذه العزلة يرمز لها 1 - PAH هي التي استعملت لاغراض الدراسة الحالية·حددت الخصائص الكيميائية للبايوسيانين المنتج من العزلة 1 - PAH بوساطة عدة تحليلات كيميائية وهي التغير بالرقم الهيدروجيني, FTIR, وHPLC والتي اكدت ان المستخلص هو صبغة البايوسيانين; بعد ذلك عرضت العزلة البرية 1 - PAH لتراكيزمختلفة من مختلف المضادات الحياتية, فاظهر المضادان Getamycin وephataximeC افضل النتائج في الحصول على الطفرات التلقائية. خضعت عدد من هذه الطافرات لاختبار قدرتها لانتاج البايوسيانين لاختيار الاكفا, فكانت الطافرة 8 - 300S هي الاكفا بانتاجها البايوسيانين, فقد انتجت3.73 ملغم/مل. اظهر البايوسيانين المنتج من الطافرة 8 - 300S صفات مماثلة لصفات البايوسيانين المنتج من العزلة البرية٬ بعد ذلك تم اختيار مدى كفاءة البايوسيانين المنتج من العزلة البرية والطافرة من Pseudomonas aeruginosa في الفعالية ضد بكتيرية ضد عدد من البكتريا السالبة والموجبة لصبغة كرام.تم فحص فعالية البايوسيانين لتقليل نمو الخطوط الخلوية السرطانية. فاظهر البايوسيانين المنتج من العزلة الطافرة بانه الاكفا في تثبيط نمو الخلايا السرطانية خط سرطان العضلات المخططة RD,و خط خلايا سرطان عنق الرحم Hela, وخط خلايا سرطان الحنجرة 2 - Hep. فضلا عن ذلك اظهر البايوسيانين المنتج من العزلة البرية والطافرة فعالية الموت الخلوي المبرمج isApoptos ضد الخط السرطاني RD. | Pseudomonas aeruginosa was isolated from different specimens (sputum, burn, wounds, ear, stool, eye, blood, and urine); these isolates formed 32% of total specimens. These bacteria were identified according to morphological, and biochemical tests. Approximately 92% of P.aeruginosa isolates were able to produce a greenish blue pigment (pyocyanin) on king A medium. One out of 45 isolates was distincted in pyocyanin production; it gave 2.8mg/ml. This isolate was designated as P.aeruginosa PAH - 1 isolate and used for further study. The chemical properties of pyocyanin produced by PAH - 1 were detected by several chemical analyses such as changing in pH, FTIR, and HPLC that was confirmed that the extracted pigment is pyocyanin. After that, the wild type isolate PAH - 1 was exposed to various concentrations of different patterns of antibiotics, Gentamycin and Cefotaxime were showed perfect results for obtaining spontaneous mutations. These mutants were submitted for production pyocyanin; the mutant P. aeruginosa S300 - 8 isolate was distincted to producing pyocyanin equal to 3.73 mg/ml. Pyocyanin produced by mutant S300 - 8 showed similar properties of that produced by wild type PAH - 1 isolate. Pyocyanin produced by wild type and mutant of P.aeruginosa isolates showed antibacterial activity against several Gram negative (Salmonella, Proteus, Shigella, Escherisia, Klebsiella) and Gram positive bacteria (Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus). The ability of this pigment to reduce the proliferative activity of cancer cell lines was examined. Pyocyanin produced by mutant S300 - 8 mutant was more efficient to inhibit growth of cancer cell lines, RD, Hela, and Hep - 2, moreover pyocyanin produced by wild type and mutant showed apoptotic activity against cancer cell line RD.

دراسة تاثير عسل النحل على البكتريا التي تلوث الحروق وامكانية استخدامه في العلاج == A study the Effect of Bee Honey on Bacteria that Contaminate Burns and the Possibility of it’s Usage in the Treatment

Author name: سندس عادل ناجي العزاوي

Supervisor name: عباس عبود فرحان الدليمي

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

Degree: Master

University: University of Diyala - College Of Science

Language: Arabic

University location: Diyala

First pages:

Abstract: اجريت هذه الدراسة خلال المدة من 15/11/2003 الى 15/7/2004 وشملت 70 مريضا راقدا في ردهة الحروق / مستشفى عام بعقوبة خلال مدة الدراسة الذين يعانون من حروق ذي درجات مختلفة وذلك لعزل البكتريا المسببة لاخماج الحروق وتشخيصها ودراسة بعض عوامل الضراوة لها وتحديد حساسيتها لبعض مضادات الحياة واختبار تراكيز مختلفة من العسل وحساب التركيز المثبط الادنى فضلا عن دراسة تاثير استخدام العسل مرهما (Ointment) في علاج الحروق.تكونت مجموعة المرضى من (38) انثى و(32 )ذكرا كما تراوحت اعمار المرضى بين (10 - 70) سنة جمعت خلال مدة الدراسة (126) مسحة من الحروق زرعت تلك المسحات على وسطي اغار الدم والماكونكي فضلا عن اجراء زرع (126) عينة دم للمرضى على مرق نقيع الدماغ والقلب. شخصت العزلات البكتيرية بالاعتماد على الصفات المظهرية والفحوص الكيموحيوية .اختبرت قابلية 6 عزلات بكتيرية من كل نوع معزول على انتاج الانزيم الحال للدم وتلازن كريات الدم الحمراء وقابليتها على الالتصاق بالخلايا الطلائية كما اختبرت قابلية البكتريا السالبة لصبغة كرام على انتاج انزيم البيتالاكتميز .اجري فحص الحساسية الدوائية للعزلات كافة لاثنتي عشرة من مضادات الحياة فضلا عن اختبار تاثير تراكيز مختلفة من العسل (بطريقة الانتشار في الاغار) ضد 18 عزلة عائدة الى الاجناس البكتيرية قيد الدراسة اما حساب التركيز المثبط الادنى للعسل فقد اجري للعزلات كافة.اختبرت فعالية العسل في علاج حروق 7 مرضى تراوحت اعمارهم من (2ـ25)سنة وبنسبة حرق اقل من 30% ثم قورنت مدة الشفاء بين المجموعة المعالجة بالعسل والمجموعة المعالجة باستخدام مرهم povidone - iodine المكونة من 7 مرضى تراوحت اعمارهم من (2ـ28) سنة وبنسبة حرق اقل من 30% مصابين بالحروق كما تم تقدير كلفة العلاج الكلية لكتا المجموعتين .اظهرت النتائج ان اعلى نسبة للمصابين بالحروق (58.57%) كانت في ضمن الفئة العمرية (اقل من 10سنة) من كلا الجنسين ، بينما ظهرت اقل نسبة (1.42%) في ضمن الفئة العمرية (70) سنة تراوحت نسبة الحرق بين (10 - 100)% اذ تراوحت نسبة الحروق لدى العدد الاكبر من المصابين (31.43%) بين(10 - 15)% في حين كان ثلاثة مصابين بنسبة حرق(70 - 85)% وكانت اسباب الحروق في الحالات كافة هي السوائل الساخنة واللهب والكهرباء اذ بلغت نسبة الوفيات بين المصابين (22.85%) .اظهرت نتائج الفحوص الزرعية نتائج ايجابية في (101)(80.16%) في حين كانت (25)(19.84%) سالبة. كانت نتائج التشخيص البكتيري ونسبها كالاتي Enterobacter spp. (35)(%34.66), Pseudomonas aeruginosa (24)(%23.76) , Staphlococcus aureus (21)(%20.79) , Escherichia coli (8)(%7.92) , Klebsiella spp. 8(%7.92) , Proteus mirabilis (5)(%4.95).فيما يتعلق بزرع عينات الدم كانت النتائج ايجابية في (13)(18.57%) في حين كانت سلبية في (57)(81.43%) واظهر التشخيص البكتيري للعزلات وجود Enterobacter spp. بنسبة (61.54%) وPs.aeruginosa بنسبة (38.56%) .بينت نتائج الدراسة الحالية ان (33.33%,16.66%) من بكتريا E.coli , Enterobacter spp على التتالي امتلكت القدرة على انتاج انزيم البيتالاكتميز بينما لم تظهر العزلات الاخرى هذه القدرة كما اظهرت (83.33%,66.67% ,66.67%, 50%) من بكتريا Ps.aeruginosa ,Staph aureus, Pr.mirabilis ,E.coli على التتالي قدرتها على انتاج الانزيم الحال للدم ، في حين لم تظهر عزلات Klebsiella spp. ,Enterobacter spp. قدرة على انتاج هذا الانزيم.كما اظهرت النتائج ايضا ان (83.33%, 66.67% ,66.67% ,50% ,33.33%) من عزلات Ps.aeruginosa ,Enterobacter spp. ,Klebsiella spp ,E.coli ,Pr.mirabilis على التتالي قدرتها على تلازن كريات الدم الحمراء ولم تظهر عزلات Staph. aureusقدرتها على ذلك ومن جانب اخر اظهرت جميع عزلات Ps.aeruginosa قدرتها على الالتصاق بالخلايا الطلائية اما عزلات Enterobacter spp., Staph aureus ,Klebsiella spp. , E.coli ,Pr.mirabilis فقد كانت نسبة الالتصاق لها (66.67% ,66.67% ,66.67% ,50% ,33.33%) على التتالي.اما فيما يخص نتائج فحص الحساسية الدوائية فقد اظهرت العزلاات تباينا واضحا وبنسب مختلفة في مقاومتها لمضادات الحياة المستعملة فقد كانت مقاومة جميع العزلات لـPenicillin (%100), ampicillin (%98.2), strephomycin (%97.9) , chloramphenicol (%86.2), ciprofloxacine (%84.1) , tetracycline (%76.9), tobramycin (%59.4) , cefotaxime (%54.5), gentamicin (%50.6), amikacin (%43.2) , cephotaxime( 90.5%) , norflaxin(%85.1) .اظهرت نتائج اختبار فعالية العسل ضد (18) عزلة بكتيرية عائدة للاجناس Ps.aeruginosa ,Enterobacter spp., Klebsiella spp.,Staph aureus, E.coli وPr.mirabilis عند التراكيز (100,80,60,40,20)%على التتالي وقد اظهرت النتائج ان معدلات اقطار مناطق التثبيط على الوسط الزرعي للعزلات البكتيرية كانت (0,0 ,6,4 ,9) ملم، (10,7,4,3,0) ملم ،(15,6,5,4,0) ملم ،(20,11,9,5,0) ملم،(25,20,10,0,0) ملم،(25,22,20,6,0) ملم على التتالي. كما اظهرت النتائج ان التركيز المثبط الادنى(MIC) للعسل لعزلات Enterobacter spp. ,Ps.aeruginosa ,Staph. aureus ,E.coli كان (40%) بيمنا كانت قيمة (MIC) للعسل لعزلات Klebsiella spp. ,Pr.mirabilis (25,30)% على التتالي. اظهرت نتائج استخدام العسل في علاج الحروق ان الحروق الملوثة ببكتريا Enterobacter spp. وبكتريا Staph. aureus بنسبة (57.14 ,28.57)% على التتالي اصبحت خالية من التلوث البكتيري بعد مرور (6) ايام على استخدام العسل في العلاج. كما اظهرت نتائج الدراسة ان متوسط مدة الشفاء في المجموعة المعالجة بالعسل ( 6.5) ايام في حين بلغ متوسط مدة الشفاء في المجموعة المعالجة بمرهم povidone - iodine (9.2) ايام اما كلفة العلاج باستخدام العسل فقد كانت اقل من كلفة العلاج باستخدام مرهم povidone - iodine | This study was conducted through the period from 15/11/2003 to /15/7/2004. It included (70) patients from burns unit in Baquba general hospital, who were suffering from different degree of burns. This study aimed to isolate and identifiy the bacterial causative agent for burns infection, study some of certain virulence factors, determinate their susceptibility pattern against certain available antibiotics and to different concentration of honey with the determination of minimum inhibitory concentration as well study the effect of use of honey in burns treatment. The patient group consist of (38) females and (32) males. Through the study period; (126) burns swabs were collected, These swabs were streaked as soon as possible on blood agar and MacConky agar plates. Furthermore blood culture for (70) samples of patients using brain - heart Infusion broth bottles. Identification of bacterial isolates were based on colony morphology and biochemical test. The ability of (6) isolates were tested for production of hemolysin , agglutination of red blood cells and then ability to adhere to epithelial cells besides the ability of gram’s negative becteria isolates for production of β - Lactamase were tested. The antibiotic susceptibility patterns of bacterial isolates against (12 ) antibiotics in addition to different concentration of honey were tested against 18 isolates from bacterial genera in this study (by diffusion in agar ) where as , the determination of (MIC) for honey was done for all isolates . The effect of honey was tested in treatment of burns for (7) patients as well as compaired the healing period between the groub treated with hony and the groub treated with povidone - iodine as well as account the total coast for each groub . The result showed that the highest percentage of patient (58.57%) were belong to the age group (>10) years old of both sexes, While the lowest percentage (1.42%) was among the age group (70) years. The degree of burns ranged between (10 - 100)% (BSA) . Most of the patient (31.43 %)had (10 - 15)% of (BSA), and only three patients had (70 - 85)%of (BSA)Generally , the cases of burns were boiling liquids , flames and electicity . the mortality rate was (22.85%). The culture tests showed that 101(80.16%) of the burns swabs yielded bacterial growth while 25 (19.84%) was negative the number and percentage of bacterial isolates were as follows : Enterobacter spp. 35(34.66%) Pseudomonas aeruginosa 24 (23.76%), Staphylococcus aureus 21 (20.79%) , Escherichia coli 8(7.92%) , Klebsiella spp. 8(7.92%) , proteus mirabilis 5(4.95%). Concerning blood culture 13 (18.57%) samples were positive and 57(81.43%) were negative for bacterial growth. Bacterial identification showed the presence of Enterobacter spp. in (61.54), Ps. aeruginose in (38.56%). Data of the present study found that (33.3, 20)%isolates of E. coli and Enterobacter spp . respectively were able to produceβ - lactamase while the other strain did not have this ability . Furthermore (83.33, 66.67, 66.67, 50)% isolates of Ps aeruginosa, Staph. aureus , pr . mirabilis , E.coli respectively were able to produce haemolysin while Klebsiella spp . , Enterobacter spp . lack this ability. The result also showed that ( 83.33, 66.67 , 50, 33.33 )%of Ps. aeruginosa , Enterobacter spp. , Klebsiella spp ., E. coli and Pr. mirabilis isolates respectively were able to agglutiniated red blood cells . While the isolates of Staph . aureus didn’t have this ability . On the other hand all Ps. aeruginosa isolates showed their ability to adhere on epithilial cells in apercentage of for each where as the isolates of Enterobacter spp ., Staph aures , KIlebsiella spp ., E.coli and Pr . mirabilis had an adherent ability in (66.67 , 66.67 , 66.67 , 50, 33.33)%respectively . The antibiotic susceptibility tests showed marked viability in the resistance of bacterial isolates to utilized antibiotic so the rate of resistance to Penicillin was (100%), Ampicilln( 98.2%) , Streptomycin (97.9%), Chloramphenicol (86.2%), Ciprofloxacin (84.1%), Tetracycline (76.9%), Tobramycin (59.4%) , Cefotaxime (54.5%), Gentamicin (50.6%), Amikacin (43.2%), Cephataxime (90.5 %)and Norflaxin (85.1%) The inhibitory ability of honey against (18) bacterial isolates belong to Ps. aeruginosa , Enterobacter spp ., klebsiella spp., Staph .aureus , E.coli and Pr . mirabilis at aconcentration (20,40,60,80,100)%. The result showed that the diameter of inhibition zone on agar was (0,0,4,6,9) mm, (0,3,4,7,10) mm, (0,4,5,6,15) mm, (0,5,9,11,20) mm, (0,0,10,20,25) mm and (0,6,20,22,25) mm respectively. Whereas the (MIC) of honey for Enterobacter spp., PS. aeruginosa,Staph. aureus , E. coli was (40%) while the (MIC ) for klebsiella spp., pr. mirabilis was (30,25)% respectively . The results of use of honey in treatment of burns showed that burns infected with Enterobacter spp., Staph. aureus with rate (57.12,28.57)% respectively become steriled after( 6) days on use of honey in treatment The results also found that the mean period of hospital stay for those patients treatment with honey was( 6.5) days compared with (9.2) days for those treated with povidone - iodine ointment , and the treatment coast was less with honey than with povidone - iodine ointment.

دراسة كيموحيوية وجزيئية لانزيم Hyaluronidase المنتج من عزلات محلية لبكتريا Pseudomonas spp. == Biochemical and Molecular Study of Hyaluronidase Produced by Local Isolates of Pseudomonas spp

Author name: ابية صباح صديق الدملوجي

Supervisor name: لينة عبد الكريم الامير | غازي منعم عزيز

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

Degree: Doctorate

University: University of Baghdad

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: جمعت 140 عينة من مصادر مختلفة تضمنت الادرار، والخمج، والجروح، والبراز، والقشع، والتهاب الاذن، والدم، وسائل من الرئة ، وللمدة من حزيران ولغاية ايلول 2005 وتم الحصول على 55 عزلة لبكتريا Pseudomonas spp. بنسبه عزل 39.3%, وكانت اعلى نسبة عزل من الخمج والجروح اذ بلغت 38.2%.2 - اختبرت حساسية العزلات المحلية لبكتريا Pseudomonas spp .اتجاه اثنا عشر مضادا للحيوية وقد ابدت العزلات مقاومة مختلفة ومتعددة للمضادات اذ كانت العزلات جميعها مقاومة لثلاثة مضادات هي : Ampicillin ، وAugmentin ، وRifampin . وكانت 82% من العزلات مقاومة ﻟ 6 - 9 مضادات ، بينما كانت 14.5% من العزلات مقاومة ﻟ 1 - 5 مضادات و3.7% من العزلات المحلية مقاومة ﻟ 10 - 12 مضادا. كما لوحظ ان اغلب العزلات كانت حساسة لمضاد Amikacin ثم Ciprofloxacin ثم Gentamycin وتباينت مقاومة العزلات ا تجاه بقية مضادات الحيوية المستعملة.3 - تم التحري عن انتاج عوامل الضراوة المختلفة للعزلات قيد الدراسة مثل : الهيمولايسين ، والايلاستيز، واليورييز ووجد ان نسبة انتاج الهيمولايسين كانت بحدود 78.1% متوزعة بشكل اساسي في نماذج الخمج والجروح ثم الادرار ، كما اتصفت العزلات المحلية بانتاجها لانزيم الايلاستيز وبنسبة 85.4% تمركزت عند عينات الخمج والجروح ثم الاذن والادرار اما نسبة انتاج اليورييز فكانت 80% للعزلات قيد الدراسة وكانت اغلبها عائدة لعينات الادرار والبراز ثم الخمج والجروح.4 - تم التحري عن انتاج انزيم الهيالورونيديز باستعمال وسط نقيع القلب والدماغ الحاوي على حامض الهيالورونك ، واتضح ان 72.7% من العزلات المحلية تمتلك القابلية على انتاج الانزيم توزعت بشكل اساسي في عينات الادرار ثم عينات الخمج والجروح والاذن.5 - درست العلاقة بين انتاج انزيم الهيالورونيديز مع عوامل الضراوة قيد الدراسة (الهيمولايسين ، والايلاستيز ، واليورييز) . واتضح ان 43.6% من العزلات الكلية كانت منتجة لهذه العوامل مع انزيم الهيالورونيديز بينما كانت 18.18% من العزلات الكلية منتجة لعاملي ضراوة وانزيم الهيالورونيديز وتميزت ست عزلات محلية بكونها منتجة لعامل ضراوة واحد مع انزيم الهيالورونيديز ، كذلك لوحظ ازدياد عدد المجموعات الخاصة بنسق توزيع عوامل الضراوة من 7 عند ربط ثلاثة عوامل فقط الى 11 عند اضافة عامل الهيالورونيديز اليها.6 - غربلت العزلات المحلية على وسط نقيع القلب والدماغ الصلب وانتخبت خمس عزلات لاعطاءها نسب تحلل عالية لحامض الهيالورونك. 7 - لوحظ عند دراسة النسق البلازميدي لخمسة عزلات محلية (P52, P2, P10, P27 ,P30) لبكتريا Pseudomonas spp. المنتجه لانزيم الهيالورونيديز باحتوائها على حزمة بلازميدية واحدة.8 - عند محاولة تحييد البلازميدات باستعمال صبغة بروميد الايثيديوم ، لوحظ اختفاء البلازمد من العزلة P2 باستعمال تركيز 2000 مايكروغرام/مليلتر من الصبغة ، وتم اختبار قدرة العزلة المحيدة في انتاج الهيالورونيديز واظهرت هذه العزلة قدرتها في انتاج الانزيم.9 - اختبرت العزلات المحلية (التي اعطت نسب تحلل عالية على الوسط الصلب) في الوسط السائل، وتم تقدير الفعالية النوعية لها بالاعتماد على طريقة Turbidimetric assay ، واختيرت العزلة المحلية P27 Pseudomonas spp. كونها الاغزر انتاجا اذ بلغت الفعالية النوعية لها 2.7 وحدة /ملغم بروتين واستعملت في التجارب اللاحقة.10 - حددت الظروف المثلى لانتاج الهيالورونيديز باستعمال وسط مرق نقيع القلب والدماغ المدعم ﺒ 0.5% مستخلص الخميرة و0.25 ملغم/مليلتر من مادة التفاعل (حامض الهيالورونك) برقم هيدروجيني 6 والملقح بعدد خلايا 1×106 خلية/مليلتر ، والحضن بالمزارع الهزازة بسرعة 50 دورة /دقيقة لمدة 18 ساعة.11 - نقي الهيالورونيديز المنتج من العزلة المنتخبة بخطوات تضمنت الترسيب باستعمال كبريتات الامونيوم بنسبة تشبع 50% ثم استخدام تقنيتي كروماتوغرافي التبادل الايوني باستخدام المبادل DEAE - Cellulose ثم الترشيح الهلامي بعمود Sephacryl S - 300 ، وتم الحصول على عدد مرات تنقية مقدارها 10.8 وبحصيلة انزيمية 20.4%.12 - درست بعض العوامل المؤثرة في فعالية وثباتية الانزيم المنقى اذ كان الرقم الهيدروجيني الامثل للفعالية 6 وثبات الانزيم 6 - 7 وظهرت اقصى فعالية للانزيم عند درجة حراره 40 م واحتفظ الانزيم بحدود 85 - 100% من فعاليته في درجات الحرارة (30 - 45) م ، واحتفظ الانزيم ﺒ 12% فقط من فعاليته عند حضنه بدرجة حراره 50 م لمدة 30 دقيقة. كما درس تاثير بعض الايونات الفلزية في فعالية الهيالورونيديز ، وجد ان لايونات الصوديوم بتركيزي 5 و10 ملي مولار فعلا تنشيطيا للانزيم اذ احتفظ الانزيم ﺒ 107% و102% من فعاليته على التوالي. بينما ثبطت فعالية الانزيم بصورة واضحة عند معاملته بايونات الحديديك Fe+3 ، اذ احتفظ الانزيم ﺒ 50% و15% من فعاليته عند معاملته ﺒ عند معاملته 5 و10 ملي مولار على التوالي ، فضلا عن ذلك لوحظ ان تاثير كل من : ايونات الحديدوز Fe+2 ، والنحاس Cu+2 ، والخارصين Zn+2 ، والزئبق Hg+2 كان اقل من الايونات السابقة، اذ احتفظ الانزيم ﺒ 60% , و53% , و74% , و66% من فعاليته عند معاملته بتركيز 10 ملي مولار لكل من الايونات على التوالي. كذلك احتفظ الانزيم بكامل فعاليته عند معاملته بمادتي EDTA وازايد الصوديوم بتركيز 5 ملي مولار ، بينما احتفظ الانزيم ﺒ 95% و76% من فعاليته عند معاملته ﺒ 5 ملي مولار من المركب Phenyl methane sulphonyl fluoride والسيستايين. | 1 - A total of 140 Samples including urine infections wounds, burns, sputum, blood, stool and lung fluid samples were collected from different hospitals and medical centers in Baghdad city, during the period June _September 2005. Fifty five isolates belonged to Pseudomonas spp.(40.7%) of which 38.2% belonged to infections and wound samples.2 - Sensitivity of local Isolates was examined against 12 antibiotics, Results showed different and multi resistance patterns to antibiotics. All isolates were resistant to Ampicillin , Augmentin and Rifampin. 82% of which were resistant to 6 - 9 antibiotics, while 14.5% of the isolates were resistant to 1 - 5 antibiotics and only 3.7% were resistant to 10 - 12 antibiotics. Amikacin, Ciprofloxacin and Gentamycin were found to be the most effective agents against most of the isolates.3 - Detection of some virulence factors (hemolysin, elastase and urease) by the local isolates was studied. Results showed that 78.1% of the isolates produced hemolysin (mainly infection and wound isolates, then urine isolates). 85.4% of were mainly elastase producers (wound and infection, ear and urine). Results also showed that 80% of isolates were able to produce urease mostly belonged to urine, stool and infection and wound isolates.4 - Detection of the ability of Pseudomonas spp.local isolates to produce hyaluronidase enzyme by using Brain heart infusion (BHI) agar that contains hyaluronic acid was studied. 72.7% of the isolates were able to produce the enzyme.5 - The relation between hyaluronidase production and other virulence factors (hemolysin, elastase and urease) was studied. The results showed that 43.6% of the isolates produced the three studied virulence factors with hyaluronidase, while 18.18% of the isolates produced two of the virulence factors with hyaluronidase, and onlysix isolates produced one virulence factor and hyaloronidase. The results also showed that the groups concerning virulence factors increased from 7 to 11 when the hyaluronidase was added as a forth virulence factor.6 - Five isolates (P27, P30 , P10 , P2, P52) of Pseudomonas spp.producing hyaloronidase were selected to carry out studies on the plasmid profile. Results showed that all five isolates contained one plasmid.7 - The results of plasmid curing by using ethidium bromide showed that the plasmid of the local isolates P2 was curried by treatment with 2000μg/ml ethidium bromide, the curried isolate kept the ability to produce hyaluronidase. 8 - Five local isolates that gave large inhibition zones on (BHI) agar were chosen for specific activity determination by using submerged cultures. The local isolate P27 was chosen to be the most producing one, it’s specific activity was 2.7 unit/mg protein.9 - The optimum conditions for hyaloronidase production determined by using submerged cultures. Results showed that the optimum media for hyaluronidase production was (BHI) broth containing 0.5% yeast extract and 0.25 mg/ml hyaluronic acid with an inoculum of 1×106 cell/ml at an optimum pH 6, after 18 hours incubation in a shaker incubator 50 cycle/min.10 - Hyaloronidase was purified from selected local isolate by using several steps including concentration by ammonium sulphate in saturation percentage of 50%, this step was followed by DEAE - Cellulose ion exchange chromatography technique and gel filtration technique using sephacryl S - 300 colum. Purification fold and recovery were 10.8 and 20.4% respectively.11 - The optimum pH for enzyme activity and stability was 6 and 6 - 7 respectively. Maximum enzyme activity was obtained at 40C º and the enzyme retained 85 - 100% and 12% of it’s initial activity at (30 - 45) Cº and 50 C º respectively.12 - The effect of some metal ions on hyaluronidase activity was studied, 5 and 10 mμ of Na+2 increased enzyme activity to 107% and 102% respectively, while the enzyme kept only 50% and 15% of it’s initial activity when treated with 5 and 10 mμ of Fe+3 respectively. The enzyme also retained 60%, 53%, 74% and 66% of it’s activity when treated with 10mμ of Fe+2, Cu+2, Zn+2 and Hg+2 respectively. EDTA and sodium azide showed no effect on hyaluronidase activity, while retained only 95% and 76% of it’s initial activity when treated with 5 mμ of PMSF and cysteine respectively.

التاثيرات المرضية للذيفان الخلوي المستخلص من بكتريا Campylobacter jejuni المعزولة محليا == Pathological Effects of the Cytotoxin Extracted from a Locally Isolated Campylobacter jejuni

Author name: سيناء محمد علي السباهي

Supervisor name: ضحى سعد صالح

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

Degree: Doctorate

University: University of Baghdad

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: This study was done to investigate the presence of Campylobacter jejuni in bloody diarrheal stool collected from hospitalized children with gastroenteritis. Campylobacter was isolated from only 4 specimens of a total number of 186; upon identification three isolates were identified as C. jejuni while the fourth isolate was found to be C. coli.Isolation of campylobacters was done using a locally prepared modified, blood - free, charcoal selective medium. It was the first time in which such medium was used for cultivating Campylobacter locally. The efficacy of this medium was very clear in comparison with the ordinarily used blood containing medium for inhibiting almost all fecal flora.Biochemical and physiological tests were used to identify and differentiate C. jejuni from the other Campylobacter species. The antibiotic sensitivity test showed that all isolates were sensitive to erythromycin, chloramphenicol, amikacin and ciprofloxacin, while resistance was found for cephalothin, ceftriaxone cefotaxime, ampicillin and trimethoprim.Tissue culture technique was used to determine C. jejuni of high cytotoxin productivity using continuous cell lines (HeLa and Vero cell lines); this isolate was used for further investigations in the study.In this study, the cytotoxin of the highest cytotoxin producing C. jejuni isolate was extracted locally for the first time and purified, using gel filtration chromatography with Sephadex G100.The purified cytotoxin revealed a single band which was observed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under the denaturing conditions. The molecular weight of the purified cytotoxin was approximately equal to 43 KDa as determined by PAGE.Using newly hatched chicks (as an animal model),the ID50 value was 3.71x10 4 cfu /ml. The ID50 decreased from 3.71x10 4 to 1.66 x 10 3 cfu/ml when 50 μg of cytotoxin was mixed with the bacterial suspension, this result reflects the role of cytotoxin on the pathogenesis of C. jejuni infection.In the present study, oral inoculation of newly hatched chicks with the C. jejuni isolate resulted in clinical and histopathological damages leading to bloody diarrhea similar to that observed in humans infected with C. jejuni.The post - mortal examination of chicks' viscera showed an accumulation of fluid in chick intestines which were distended with watery fluid; also there was obvious hepatomegaly with yellow spots, and swelling of the gall bladder. The associated infection with the C. jejuni cells and their cytotoxin induced more progressive tissue damage represented by a more severe intestinal distension and congestion.The histopathological examination of the small and large intestine of chicks infected with Campylobacter cells, showed mucosal sloughing, congestion of blood vessels, infiltration of inflammatory cells in the mucosal and submucosal layers, and accumulation of edematous fluid in the mucosal layer. The examination of chicks infected with Campylobacter cells and the cytotoxin revealed the presence of the same lesion, but more severely with the presence of hemorrhage in the lumen. These results could be important evidence of the role of cytotoxin as a virulence factor on the pathogenicity of C. jejuni

عزل وتشخيص البكتريا العصوية (Bacillus) المنتجة لانزيمات التحلل المائي (الحلمهه) (Hydrolases) المتحملة للحرارة == Isolation and identification of Bacillus producing thermotolerant hydrolases

Author name: عدنان حنون عباس

Supervisor name: رشيد محجوب مصلح

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology - Bacteria

Degree: Doctorate

University: University of Baghdad

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تم الحصول على 97 عزلة من البكتريا العصوية ( Bacillus ) من جمع 200 عينة تربة ومياه في الفترة مابين تموز/تشرين اول 2008 من مواقع مختلفة من العراق بعد التشخيص الاولي ( صبغة كرام, تكوين السبورات, انتاج الكاتاليز ) وتلقيح العينات على وسط ال Thermus agar وتنميتها على درجة 50°C لفترة 24 ساعة. اظهــــرت نتائج الاخــــــتبارات الكيمــوحيــــويـــــة ان 56 عزلة تربـــــــة صنفت على انها B. laterosporus 35.71% , B. circulans 16.07% , B. stearoyhermophilus 14.28%, B. polymyxa 12.5% , B. macroides 7.14%, B. mycoides 7.14% , B. lentus 3.57% , B. popilliae 1.78% , B. chitinosporus 1.78 , بينـــما صنفت 41 عـــــــــزلة مياه عــــلى انها B. laterosporus 26.82% , B. circulans 26.82% , B. stearothermophilus 4.87% , B. polymyxa 4.87% , B. macroides 9.75% , B. mycoides 2.43% , B. lentus 7.31% , B. popilliae 4.87% , B. filicolonicus 4.87% , B. brevis 2.43% , B. larvae 2.43% , B. pumilus 2.43% . اظهرت عزلات ال ( Bacillus ) المعزولة من التربة والمياه ايجابيتها في انتاج الانزيمات المتحملة للحرارة بعد اختبارها على وسـط الاكار الصـلب, كالبروتييــز ( 73.17% ) ( 89.28% ) , الاميـــــــــليز ( 51.21% ) ( 55.35% ) , اللايبيــــــــــــز ( 95.12% ) ( 91.07% ) , السيليليز( 60.97% ) ( 85.71% ) , والكايتينيز( 92.68% ) ( 85.71% ) , على التوالي, في فترات حضانـــة مختلفة ودرجة حرارة 50°C . من جهة اخرى, قيست قابلية عزلات ال ( Bacillus ) والبالغة نسبتها ( 41.23% ) على انتاج انزيمات التحلل المائي كالبروتييـــز والاميليــز واللايبيـــز والسيليليـــز والكايتينيــز, باجمعها, حيث اظهرت النتائج بان سلالات ال B. polymyxa كانت الافضل في انتاج البروتييز والاميليــز والسيليليــز, بينما سلالات ال B. lentus كانت الافضل في انتاج الكايتينيـــز, اما اللايبيـــزفقد تم انتاجــــــــه من قبل سلالات ال B. circulans , B. stearothermophilus , B. polymyxa , B. mycoides وB. lentus , على اوساط زرعية وفترات حضانة مختلفة ودرجة حرارة 50°C. هذا وقد حددت الظروف المثلى لانتاج الاميليز من العزلة B. polymyxa AS 4/5 واظهرت النتائج ان الوسط الامثل للانتاج والمحضر مختبريا متكون من 2% نشا, 1% تربتون, 0.05% كبريتات المغنيسيوم, 0.05% كلوريد الصوديوم و0.02% كلوريد الكالسيوم , برقم هيدروجيني 7, وبدرجة حرارة 50°C لفترة 48 ساعة. تم استخلاص الاميليــز من الوسط الزرعي وتركيزه بواسطة السكروز, وقد اظهرت النتائج الحصول على الاميليز بفاعلية نوعية 2.36U/mg protein, في المــرحلة الاولى تمت تنقية الاميليز بطريقة كروماتوغرافيا الوجبة Batch Chromatography واعقبت هذه المرحلة استخدام عمود التبادل الايوني Ion exchange chromatography باستخدام المبادل DEAE - Cellulose column . وقد اظهرت النتائج الحصـــول على الاميلــــيز بفاعلية نوعية 6.76U/mg protein وبعدد مرات تنقية بلغ 2.86 وبحصيلة نهائية 18.65% . تمت ايضا دراسة توصيف الانزيم, واظهرت النتائج بان الفعالية الانزيمية تزداد بزيادة درجة الحرارة الى 90°C بينما اظهر الاميليزثباتييتـــه في درجات الحرارة 40°C, 50°C, 60°C , في حضانة لمدة 30 دقيقـــة, اما الفاعلية المثلى للانزيم بالرقم الهيدروجيني pH 5, اما ثباتية الانزيم فتكون في الارقام الهيدروجينية مابينpH 4 - 10 في درجة 50°C لفترة 30 دقيقة, وبفاعلية متبقيــة قصوى 78.57% في .pH 5 اما النتائج المتعلقة بتاثير الايونات الفلزية على الانزيم, تبين ان لكلوريد الزئبق تاثير عالي على الانزيم بفاعلية متبقية 46.47% و40.84% بتركيز 5mM و10mM , على التوالي, اما كلوريد المنغنيز له تاثير قليل على الانزيم بفاعلية متبقية 79.81% و81.69% بتركيز 5mM و10mM, على التوالي, في درجة 50°C لفترة 30 دقيقة. تعمل المواد الكلابية مثل EDTA والمواد المختزلة mercaptoethanol على تثبيط الفاعلية الانزيمية, حيث تؤثر المواد الكلابية ( EDTA ) على الانزيم بفاعلية متبقية 57.74% و52.58% بتركيز 2mM و5mM, على التوالي, اما المــــواد المختزلـــــــــة ( mercaptoethanol ) يكون تاثيرها بفاعلية متبقية 51.17% و40.37% بتركيز 2mM و5mM, على التوالي, في درجة 50°C لفترة 30 دقيقـــــــــة. | Ninety - seven isolates of Bacillus were obtained from 200 soil and water samples, collected between July to October / 2008, from different local sites of Iraq, by primary identification ( gram stain, endospore - forming and catalase production ) after incubation at 50°C for 24h on thermus agar. Biochemical test showed that fifty - six soil isolates were classified as B. laterosporus 35.71%, B.circulans 16.07%, B.stearothermophilus 14.28%, B.polymyxa 12.5%, B.macroides 7.14%, B.mycoides 7.14%, B.lentus 3.57%, B. popilliae 1.78% and B.chitinosporus 1.78%, whereas forty - one water isolates were classified as B.laterosporus 26.82%, B.circulans 26.82%, B.stearothermophilus 4.87%, B.polymyxa 4.87%, B.macroides 9.75%, B.mycoides 2.43%, B.lentus 7.31%, B. popilliae 4.87%, B.filicolonicus 4.87%, B.larvae 2.43%, B.brevis 2.43% and B. pumilus 2.43%. Thermotolerant enzymes were produced from soil and water Bacillus species as, protease ( 89.28% ) ( 73.17% ), amylase ( 55.35% ) ( 51.21% ), lipase ( 91.07% ) ( 95.12% ), cellulase ( 85.71% ) ( 60.97% ) and chitinase ( 85.71% ) ( 92.68% ) , respectively, after culturing on solid agar media with different incubation period, at 50°C. So, 41.23% of soil and water Bacillus isolates were detected for hydrolases production as ( protease, amylase, lipase, cellulase and chitinase ) together, and showed that B. polymyxa strains were the best bacteria in protease, amylase and cellulase production, whereas B. lentus strains was a good chitinase producer. Lipase was produced by several Bacillus strains as B. circulans, B. stearothermophilus, B. polymyxa, B. mycoides and B. lentus, after culturing on different media and incubation period, at 50°C. Thermotolerant amylase production conditions by B. polymyxa AS 4/5 were studied, the highest amylase production was observed when the bacteriaSummary IIwas cultured in medium containing 2% starch, 1% tryptone, 0.05% MgSO4, 0.05% NaCl and 0.02% CaCl2 with pH 7 and incubated at 50°C for 48h. Amylase was extracted from production medium and concentrated with sucrose, the specific activity of amylase was 2.36U/mg protein. Purification of amylase was performed by ion exchange chromatography Cellux - Carboxymethyl ( batch chromatography ), followed by second step of purification by ion exchange chromatography on DEAE - Cellulose column, the results showed that the specific activity was 6.76U/mg protein with 2.86 purification folds and 18.65% yield. Thermotolerant amylase displayed a wide temperature range of activity at 40 - 90°C with highest activity at 90°C and enzyme was stable at 40 - 60°C for 30min. The optimum pH for amylase activity was pH 5, the enzyme was stable at pH 4 - 10 for 30min at 50°C with maximum remaining activity 78.57% at pH 5. Treatment of thermotolerant amylase with metal ions showed that HgCl2 reduced amylase activity, the remaining activity was 46.47% and 40.84% at concentration 5mM and 10mM of HgCl2, respectively. Whereas MnCl2 had lower effect on amylase activity, the remaining activity was 79.81% and 81.69% at concentration 5mM and 10mM of MnCl2, respectively, after 30min at 50°C. Bacillus polymyxa amylase was treated with 2mM and 5mM of EDTA and mercaptoethanol, the two compounds had inhibitory effect on the enzyme, the remaining activity of EDTA treated enzyme was 57.74% and 52.58% at 2mM and 5mM, respectively, while the remaining activity of enzyme treated with 2mM and 5mM mercaptoethanol was 51.17% and 40.37%, respectively, after 30min at 50°C.