دراسة كيموحيوية وجزيئية للبروتين A المنتج من العزلة المحلية لبكتريا Pseudomonas aeruginosa == Biochemistry and Molecular Study of Exotoxin A from Local Isolate of Pseudomonas aeruginosa
Author name:
خولة جبر خلف المحمداوي
Supervisor name:
زهير نعمان حمد العاني | رعد خليل الحسيني
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Bacteria
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3250 - p.pdf
Abstract:
تضمنت هذه الدراسة عزل بكتريا P.aeruginosa وتشخيصها من عينات المصادر المختلفة (سريرية وبيئية)، اذ اشتملت الدراسة على 200 عينة توزعت على 100 عينة سريرية تمثلت بعينات التهابات الجروح الحروق والمجاري البولية وحالات التهاب الاذن الوسطى، اما العينات البيئية فكانت 100 عينة، 50 منها جمعت من المياه و50 جمعت من التربة. اظهرت النتائج ان نسبة وجود بكتريا P.aeruginosa في العينات السريرية اعلى مقارنة بالعينات البيئية، اذ بلغت نسبة عزلها (70%) في العينات السريرية بينما كانت (62%) في العينات البيئية توزعت بين (51.6%) عينات المياه و(48.3%) لعينات التربة. كما تناولت الدراسة قابلية عزلات هذه البكتريا المعزولة من المصادر المختلفة على انتاج الذيفان الخارجي A وتبين من النتائج ان (90%) من العزلات السريرية و(60%) من عزلات المياه و(40%) من عزلات التربة لها القابلية على انتاج الذيفان الخارجي A، وتباينت هذه العزلات المنتجة للذيفان EXA في تفاعلها في جلد الارنب اذ اعطت العزلات السريرية (44.4%) افة مبكرة و(55.5%) افة متاخرة، اما عزلات المياه فكانت (33.3%) منها ذات افة مبكرة و(66.6%) ذات افة متاخرة في حين اعطت عزلات التربة (50%) افة مبكرة و(50%) افة متاخرة. اظهرت النتائج ان جميع عزلات P.aeruginosa منتجة لانزيم البروتيز ماعدا العزلة KH50 وقد كانت هذه العزلة منتجة للذيفان EXA واختيرت لغرض استخلاص وتنقية الذيفان EXA. استخلص الذيفان EXA من العزلة KH50 وتمت عملية تنقيته باستخدام كروموتوغرافيا عمود المبادل الايوني (DEAE - cellulose) وعمود هلام Sephacryl S - 200. بعدها تم تعيين الوزن الجزيئي للذيفان EXA بوساطة كروموتوغرافيا الترشيح الهلامي باستخدام عمود Sephacryl S - 200 وقد بلغ 63.095 كيلو دالتون. كما وحددت الجرعة المميتة الوسطى LD50 للذيفان عند حقنه بتراكيز مختلفة في فجوة بريتون الفئران وكانت الجرعة المميتة الوسطى هي0.5 مايكروغرام/ملليتر/ فارة. واوضحت الدراسة النسيجية المرضية قدرة الذيفان EXA على احداث تغيرات نسيجية في الفئران البالغة بعد حقنها بـ 0.01 مايكروغرام/ملليتر من الذيفان ولمدة اربعة ايام من الحقن اذ لوحظ وجود افات نسيجية في كل من الكبد والكلى والطحال. اظهرت نتائج تجارب تحييد العزلة المحلية KH50 المنتجة للذيفان EXA باستخدام مواد التحييد Acridine orange وEthedium bromide بتركيز (1024، 256) مايكروغرام/ ملليتر على التوالي، ان الجينات المشفرة لهذا الذيفان هي كروموسومية الموقع. | This study includes the isolation and identification of Pseudomonas aeruginosa from two hundred samples collected from different sources (environmental and clinical sources). One hundred samples collected from clinical sources include patients with wounds, burn, urinary tract, and ear infections, while environmental source included one hundred samples from soil and water. Results indicate that the high percentage of isolation from clinical sources was (70%), while the percentage of isolation from environmental sources was (62%) distributed between (51.6%) from water samples and (48.3%) for soil. The ability of producing Exotoxin A by different isolates of P.aeruginosa was studied, (90%) of clinical isolates, (60%) of water and (40%) of soil isolates were toxin A produced. These isolates differ in their reaction on Rabbit’s skin, early hemorrhagic lesions were noticed in (44.4%) of clinical isolates while (55.5%) of isolates showed late band lesions. (33.3%) Water isolates showed early hemorrhagic lesions and (66.6%) for late band lesion. (50%) of soil isolates gave early hemorrhagic lesion and (50%) gave late band lesion. On the other hand, local isolate KH50 (protease negative) was selected for the study of exotoxin A (extraction and purification). Extraction and purification of P.aeruginosa exotoxin A were done using ion exchange chromatography, DEAE - cellulose and gel filtration with sephacryl S - 200. Molecular weight of the purified exotoxin A was measured by sephacryl S - 200 and it was around (63.095) killo dalton. LD50 of exotoxin A determination for local strain KH50 was about 0.5 g/ml/mouse. Histopathological investigations proved the ability of Exotoxin A to cause generalized infections in mice. Adult mice were injected with exotoxin A at a concentration of 0.01 g/ml. Histological sectioning of the organs was done after 4 days from injection. Examination of the liver, spleen and kidneys showed the existence of lesions and necrosis. Curing experiments showed that genetic markers responsible for exotoxin A production were carried on chromosome rather than plasmid, since cured isolates retain their ability to produce disease in rabbit skin.
