Share
التحري عن مقاومة المجموعة الامينوكلايكوسيدية المتواسطة بمثيلة 16S rRNA في بعض انواع البكتريا السالبة لكرام == Detection of 16S rRNA Methylation Gene between Two Species of Gram Negative with High Level Resistance to Aminoglycosides
Author name:
اسراء محمد صفي عبد علي الكاظمي
Supervisor name:
سوسن ساجد محمد علي الجبوري
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Bacteria
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3186 - p.pdf
Abstract:
• جمعت 100 عزلة من البكتريا السالبة لصبغة كرام مشخصة مبدئيا بانها وEscherichia coli Pseudomonas aeruginosa من مرضى باصابات مختلفة في مستشفى الكندي التعليمي ومستشفى الكاظمية التعليمي ومستشفى ابن البلدي ومستشفى الامام علي خلال الفترة مابين تموز الى تشرين الثاني2011. تضمنت 68 عزلة من خمجات المجاري البولية و8 عزلات من عينات القشع و6 من خمجات الحروق و18 عزلة من اصابات تجرثم الدم. • شخصت العزلات مبدئيا بزراعتها على وسطي اكار الماكونكي واكار الدم. تبع ذلك اجراء عدد من الفحوص المورفولوجية والكيموحيوية ثم شخصت العزلات بشكل نهائي ودقيق باستخدام اشرطة api20E.تبعا لذلك توزعت العزلات المائة بواقع 58 عزلة تعود لبكتريا E. coli اما العزلات ال 42 الباقية فكانت لبكتريا P. aeruginosa.• اجري اختبار فحص الحساسية للمضادات الحيوية بطريقة انتشار الاقراص لـ 7 من مضادات المجموعة الامينوكلايكوسيدية . اوضحت النتائج وجود اختلافات واضحة في نمط المقاومة المظهري لهذه العزلات .فقد بلغت نسبة مقاومة بكتريا E. coli لمضاد الاميكاسين 34.4%)20\58)و53.4%(31\58)للنتلامايسين و67.2%(39\58) للتوبرامايسين و87.9% (51\58 ) لللسيسومايسين , و94.8%(55\58 ) لكلا من مضادي الكانامايسين والستربتومايسين واخيرا بلغت النسبة للجنتامايسين 98.2%(57\58) . كما هو الحال مع بكتريا E. coli , فقد ظهر ان افضل فاعلية ضد بكتريا P.aeruginosa كانت للاميكاسين حين بلغت نسبة المقاومة45.2%(20\42) تلا ذلك مضاد النتلامايسين52.3%(22\4222) وبلغت 57.1%(27\42) و59.5%(25\42) للسيسومايسين والتوبرامايسين على التوالي اما للكانامايسين فقد بلغت 90.4%(38\42) للستربتومايسين 92.8%(39\42) واعلى نسبة مقاومة كانت ضد مضاد الجنتامايسين حيث بلغت 95.2%(40\42). • استخدمت طريقة التراكيز المتضاعفة المتسلسلة لحساب التركيز المثبط الادنى لست من مضادات المجموعة الامينوكلايكوسيدية. بينت النتائج وجود اختلافات في قيم MIC المحسوبة لهذه النوعين من العزلات.فمن اصل (58) عزلة من بكتريا E.coli كانت منها 20 مقاومة للاميكاسين(%34.4 ( وبقيم MIC تراوحت ما بين(64 - 128 مايكروغرام\مل), 56 عزلة)87.5%(مقاومة للبارومايسين وبقيم MIC تراوحت ما بين)16 - 1024مايكروغرام\مل) , 57 عزلة) %98.2) مقاومة للستربتومايسين وبقيم MIC تراوحت ما بين(16 - 256مايكروغرام\مل), وكانت جميع العزلات (100%) مقاومة لكل من الجنتامايسين والنيومايسين والكانامايسين وبقيم MIC تراوحت ما بين)128 - 1024مايكروغرام\مل) للجنتامايسين والنيومايسين بينما تراوحت للكانامايسين ما بين(128 - 1024مايكروغرام\مل(. اما بالنسبة لبكتريا P.aeruginosa كانت20 (47.6%) عزلة مقاومة للاميكاسين وبقيم MIC تراوحت ما بين(16 - 1024مايكروغرام\مل) و39 عزلة (92.5%)عزلة مقاومة للكانامايسين والستربتومايسين وبقيم MIC تراوحت ما بين(64 - 1024مايكروغرام\مل)و)16 - 1024مايكروغرام\مل) على التوالي,جميع العزلات وبنسبة (100%) كانت مقاومة للجنتامايسين والنيومايسين وبقيم MIC تراوحت ما بين )16 - 1024مايكروغرام\مل), واخيرا جميع العزلات اظهرت مقاومة تامة للبارومايسين (100%) وبقيم MIC تراوحت ما بين)32 - 1024مايكروغرام\مل).• تم التحري عن انتاج انزيم البتالاكتاميز باستخدام اختبار الاشرطة السريع, وتضمن اربع اختبارات : اختبار المسح الاولي للبتالاكتاميز,اختبار انزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف ESβLs التاكيدي وMetallo - β - lactamase وانزيم AmpC. اظهرت النتائج انه 84 عزلة من مجموع 100 (84%) كانت موجبة للمسح الاولي للبيتالاكتميز توزعت مابين50 عزلة(86.2%) لبكتريا E.coli و34عزلة (80.9%) لبكتريا P.aeruginosa. اما بالنسبة للـ ESβLs فكانت نسبة العزلات المنتجة له هي 83% توزعت كالاتي 86.2%(50\58) لبكتريا E.coli و80.9%(34\42) تعود لبكتريا P.aeruginosa اما نتائج MβL فقد كانت اقل نسبيا لتصل الى 75% موزعة مابين %77.5)45\58) لبكتريا E.coli و71.4% (30\42) لبكتريا P.aeruginosa بينما 70% من العزلات كانت منتجة لانزيم AmpC توزعت مابين 56.8%(33\58) لبكتريا E.coli و88.9%(37\42) لبكتريا P.aeruginosa.• تم التحري عن المحتوى البلازميدي لعدد من العزلات المنتخبة والتي اظهرت مستوى مقاومة عالية وذلك باستخدام modified alkaline lysis method. اظهرت النتائج ان معظم العزلات كانت حاملة لاكثر من بلازميد باحجام مختلفة , وبعض منها ت احتوى على بلازميدات كبيرة.• اعتمدت طريقتان مختلفة لتحضير الدنا القالب لغرض استخدامها في التفاعل التضاعفي لسلسلة الدنا ( PCR) وهي : طريقة الغليان وطريقة استخلاص البلازميد. اظهرت النتيجة ان طريقة عزل البلازميد كانت ادق في اظهار النتائج بالمقارنة مع طريقة الغليان.مع ذلك فان الطريقة الاولى هي الاكثر شيوعا في العمل الروتيني .• اختيرت 20 عزلة من كل نوع لغرض الدراسة الجينية اعتمادا على مستوى المقاومة العالية الذي اظهرته هذه العزلات . استخدمت تقنية التفاعل التضاعفي لسلسلة الدنا (PCR) للتحري عن جين blaCTX - M المسؤول عن انتاج ESβLs فضلا عن التحري عن ستة من جينات مثيلة 16S rRNA ArmA )و RmtAو RmtBو RmtCو RmtD وNpmA ) .• بينت نتائج التحري عن جين blaCTX - M في E.coli ان جميع العزلات حاملة لهذا الجين (100%) لتقل النسبة الى 85% (17\20( لبكتريا P.aeruginosa بالاعتماد على وجود القطعة المكثرة بحجم 550 زوج قاعدي بالمقارنة مع دليل الدنا المستخدم بحجم 100 زوج قاعدي المرحل في 1%من هلام الاجاروز .• اوضحت نتائج التحري عن جينات مثيلة 16S rRNA بتقنية الـ (PCR) لعزلات E.coli ان16 عزلة من مجموع20 (80%) كانت حاملة لجين ArmA اعتمادا على وجود القطعة مكثرة بحجم 846 زوج قاعدي بالمقارنة مع دليل الدنا الحجمي (100 زوج قاعدي )بعد الترحيل في هلام الاجاروز 1% فيما اظهرت عزلة واحدة من مجموع20 (5%) امتلاكها لجين المثيلة RmtB بحجم قطعة مكثرة 584 زوج قاعدي , بينما كانت 3 عزلات من مجموع 20(15%)حاملة لجين RmtC بالاعتماد على وجود حزم بحجم 711 زوج قاعدي , وعزلة واحدة فقط (5%) حاملة لجين RmtD بوجود قطعة مكثرة بحجم 500 زوج قاعدي , واخيرا فان جين المثيلة السادس وهو npmA فقد حدد في عزلة واحدة (5%) من اصل 20 عزلة بالاعتماد على وجود حزمة بحجم 641 زوج قاعدي.• اظهرت نتائج التحري عن جينات مثيلة 16S rRNA في بكتريا P.aeruginosa وجود نوع واحد من هذه الجينات وهو ( RmtD) وقد حدد في 3 عزلات من اصل20 (15%)بالمقارنة مع دليل الدنا الحجمي 100 زوج قاعدي.• كلا نوعي البكتريا E.coli وP.aeruginosa لم يظهرا احتوائها على جين RmtA , بينما كان جين ArmA هو الجين السائد في بكتريا E.coli.• اظهرت النتائج ان عزلة واحدة من بكتريا E.coli رقم(37) حاملة لخمسة انواع من جينات مثيلة 16S rRNA فضلا عن جينblaCTX - M ,بينما كانت اربع عزلات من بكتريا E.coli ذات التسلسل(11 و32 و40و42) لاتحتوي على اي جين من جينات المثيلة ماعدا جينblaCTX - M .• اظهرت نتائج الدراسة الحالية ان هنالك ترابط بين التنميط المظهري لمقاومة المضادات مع التنميط الجيني , فقد لوحظ ان العزلات الحاملة لجين المثيلة 16S rRNA هي العزلات التي اظهرت مقاومة عالية لكل من المضادات الاميكاسين والجنتامايسين ولكل المجموعة الامينوكلايكوسيدية ماعدا الستربتومايسين لبكتريا E.coli وبكتريا P.aeruginosa فضلا عن مقاومتهما لبقية المضادات ,لكن بكتريا P.aeruginosa اظهرت احتوائها على نوع واحد من جينات المثيلة وهو (RmtD) وقد ظهرت في العزلات رقم (14و28و37) بالاضافة الى جين blaCTX - M بالرغم من مقاومتها العالية لمضادات مجموعة الامينوكلايكوسيدية, وهذا يعزى لاحتوائها على اليات مقاومة اخرى مثل مضخة الدفق وتحوير الانزيمات وتغيير حاجز النفاذية والاكثر شيوعا هو مضخة الدفق للمضاد. • بينت النتائج على الاقل وجود احدى جينات المثيلة مرافقة لجينات مقاومة اخرى مثل جين blaCTX - M المسؤول عن انتاج ESβLs سيما في بكتريا . E.coli | A total of (100) clinical isolates of gram negative bacteria primary identified as Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa were collected from Al - Kindey hospital, Al - Kadhymia teaching hospital, Ibn - Albalady hospital and Alemam - Ali hospital in Baghdad city , during the period between July 2011 to November 2011. They were obtained from mid stream urine from patients suffering from urinary tract infections (68 isolates), sputum samples from patients suffering from respiratory tract infection (8 isolates), wounds infections (6 isolates) and from bacteraemia (18 isolates).• The isolates were initially identified by culturing on MacConkey agar and blood agar then diagnosed by performing some morphological and biochemical tests. A confirmatory test as a final diagnoses was done using api20E system. According to this, the 100 isolates were distributed as 58 isolates of Escherichia coli while the remaining 42 isolates were Pseudomonas aeruginosa.• Antibiotic susceptibility test for 7 aminoglycoside antibiotic was performed using disc diffusion method. The results demonstrated a clear differences in the phenotypic resistance among the isolates. The percentage of highest resistance in E.coli isolates reached 98.2%(57\58) for gentamicin while lower reached 34.4% (20\58) for amikacin. As with E.coli the best activity against P.aeruginosa the highest resistance was against gentamicin when the percentage reached 95.2%, while the lower percentage aganist amikacin when the percentage of resistance was 47.6%(20\42). • Two fold serial dilution agar was used to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) using six aminoglycosides antibiotic. The results showed that there were differences in the MICs values among the two species. Out of (58) E.coli isolates, 20(34.4%) were resisted to amikacin (MIC ranged from 64–128 µg /ml) , and all isolates 58 (100%) were resisted to gentamicin, neomycin and kanamycin when the MICs ranged from (32–1024µg /ml) to gentamicin and neomycin while it was (128–1024 µg /ml) to kanamycin. In P.aeruginosa, 20(47.6%) isolates were resisted amikacin (MIC ranged from 64–128 µg /ml), all isolates(100%) were resistant to gentamicin and neomycin (MIC ranged from 16–1024 µg /ml) and finally all the isolates showed complete resistance towards Paromomycin (100%) with MIC ranged from (32–1024µg /ml).• The detection of β - lactamases production was performed using the easy rapid strip test including four tests : preliminary screening test for β - lactemase, Extended - Spectrum Beta - Lactamases (ESβLs) confirmation, Metallo β lactamases and AmpC enzymes. The results showed that 84 isolates out of 100 (84%) were positive in Preliminary screening of β - lactamases distributed between 58(86.2%) for E.coli and 42(80.9%) for P.aeruginosa . In ESβL, the rate of producer isolates were 83% distributed as (50/58)86.2% of E.coli isolates and (34/42)80.9% for P.aeruginosa. Results of MβL production revealed that the rate of producer isolates reduced to 75% distributed as (45/58)77.5% for E.coli and (30/42)71.4% for P.aeruginosa, while 70%of the isolates were AmpC producers distributed as (33/58)56.8% and (37/42)88.09% for E.coli and P.aeruginosa respectively.• The detection of plasmid content was done for selected isolates which showed very high level of resistance using modified alkaline lysis method. The results showed that most of the isolates were harboring more than one plasmids of different size, and some isolates appeared to have mega plasmid. • Template DNA used for polymerase chain reaction (PCR) reaction was prepared using two different methods : the boiling method and the plasmid DNA. The results revealed that the plasmid DNA was more specific in demonstrating the result as compared with the boiling method however, the first method is more common in routine work. • Twenty isolates from each species were selected according to their high - level resistance for the genotypic study. PCR technique was performed to detect blaCTX - M gene responsible for ESβLs production beside detecting six 16S rRNA methylation genes including (ArmA, RmtA, RmtB, RmtC, RmtD, and NpmA). • The results for detecting blaCTX - M gene in E.coli showed that all of the isolate (100%) were harboring this gene, while the rate decreased to 85%(17/20) for P.aeruginosa based on the presence of an amplified segment with 550bp (as compared with 100bp DNA ladder) in agarose gel (1%) .• The results of detection 16S rRNA methylation by PCR in E.coli isolate showed that 16 isolates out of 20 (80%) were harboring ArmA based on the presence of 846 bp bands (as compared with 100bp DNA ladder) after running in (1%) agarose gel. Only one isolates out of 20(5%) harbored RmtB methylation gene with amplified size 584bp, while 3 isolates out of 20(15%) contains RmtC gene based on the presence of 711bp bands , 1 isolates(5%) harbored RmtD gene and the size of the amplified segment was 500bp, and the final sixth methylation gene was npmA which was detected in only one isolate (5%) out of 20 based on the presence of 641bp bands. • The results of detection 16S rRNA methylation in P.aeruginosa showed that only one methylation gene( RmtD) was found in the isolates and it was detected in 3 isolates out of 20 (15%) as compared with DNA ladder 100bp.• Both of bacteria E.coli and P.aeruginosa didn’t show any positive results to RmtA gene, while ArmA gene was the most predominant in E.coli.• The results showed that there was only one E.coli isolate(no.37) harbored the five 16S rRNA methylation genes beside blaCTX - M gene, while four E.coli isolates (no. 11, 32, 40 and 44) devoid any one of them except blaCTX - M gene. • The results of the current study showed that there was a correlation between phenotypic and genotypic resistance pattern. The isolates harboring 16S rRNA methylation genes are considered to show high - level resistance to amikacin, gentamicin and even to all aminoglycosides except streptomycin, for E.coli and P.aeruginosa beside resistance to other antibiotic, but in P.aeruginosa only one methylase gene (RmtD) gene appeared in three isolates(no.14, 28,37) in addition to blaCTX - M gene despite the high level of resistance towards aminoglycoside group and this is due to contain other types of resistance such as efflux mechanisms, aminoglycoside modifying enzymes and impermeability of the cell wall may cause reduced susceptibility to aminoglycosides and the most prevalent was efflux mechanisms.• At least one Methylation resistance genes was coupled with other resistance gene such as blaCTX - M gene responsible for ESβLs production
