دراسة بكتيرية ومناعية لعوامل الضراوة المستخلصة من بكتريا Moraxella catarrhalis المعزولة من اصابات القناة التنفسية == Bacteriological and Immunological Study of Virulence factors extracted from Moraxella catarrhalis Isolated from Respiratory Tract Infections
Author name:
حوراء عبد الامير علي الدهان
Supervisor name:
سوسن حسن عثمان كورجي | نجاح رايش هادي
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Bacteria
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3237 - p.pdf
Abstract:
تم عزل وتشخيص 60عزلة من بكتريا Moraxella catarrhalis من 344 عينة مرضية وبنسبة 17.4% موزعة كالاتي (6.7 , 11.7 , 12.5 , 27.6 , 30) % لكل من مسحات الاذن ومسحات الانف وعينات القشع ومسحات البلعوم ومسحات اللوزتين على التوالي من المرضى المراجعين الى العيادة الاستشارية للانف والاذن والحنجرة والعيادة الاستشارية الصدرية في مستشفى الحكيم العام في محافظة النجف ومن مختلف الاعمار ولكلا الجنسين وللفترة من حزيران 2004 وحتى كانون الاول 2004م. اعتمدت الصفات الزرعية (للمستعمرات) والشكلية (للبكتريا)والاختبارات الكيماحيوية لتشخيص العزلات، فضلا عن اعتماد نظام API - NH . كانت النسبة المئوية لعزل البكتريا من الاناث (18.8%)اكثر مما هو عليه في الذكور (16.3%) فيما سادت الفئة العمرية 1ـ10 سنة حيث بلغت نسبة عزل المسبب المرضي فيها 20.4%. لغرض التحري عن طبيعة مقاومة العزلات قيد الدراسة للمضادات الحيوية المختلفة ،فقد اخضعت جميع العزلات لاختبار حساسيتها لـ 12 نوعا من المضادات الحيوية التي تستعمل في علاج الاخماج البكتيرية ،اذ اظهرت العزلات مقاومة تامة لكل من المضادات الحيويةAmpicillin وAmoxycillin وTetracyclin وبنسبة 100% لكل مضاد ، في حين اظهرت العزلات مقاومة معتدلة وبنسب (73.3 ، 71.7 ، 66.7 ، 61.7 ، 60 ، 58.3 ) % لكل من المضادات الحيوية Cefotaxime،Ciprofloxacin ،Nitrofurantoin ،Nalidixic acid ، Cephalothin وGentamycinعلى الترتيب ،لكنها كانت مقاومة وبدرجة منخفظة تجاه Chloramphenicol ,Cephalexin , Pipracillin اذ بلغت نسب المقاومة لها(30 , 36.7 , 38.3)% على الترتيب .واظهرت معظم العزلات مقاومة مشتركة لعدد من المضادات الحيوية قيد الدراسة ، كما واظهرت 91.7% من العزلات قدرتها على انتاج انظيم البيتالاكتاميز . في محاولة للتحري عن عوامل الامراضية لهذه البكتريا والمتمثلة بعوامل الالتصاق والاستعمار اظهرت العزلات امتلاكها لعامل الاستعمار الاول (CFA/I) والثالث (CFA/III) وبنسب (93.3 ،96.7 )% على التوالي ، في حين لم تظهر ايا من العزلات امتلاكها لعامل الاستعمار الثاني (CFA/II) .اظهرت 22 عزلة من بكتريا M.catarrhalis (36.7%) قدرتها على انتاج انظيم البروتيز الخارج خلوي في حين لم تظهر ايا من العزلات قابليتها على انتاج انظيم الهيمولايسين والسايدروفورات , فضلا عن عدم قدرتها على تكوين المحفظة . ولمعرفة قابلية العزلات البكتيرية على تكوين الشعيرات (Fimbriae) اجري فحص تكوين الغشاء الرقيق حيث تمكنت 80 % من هذه العزلات من تكوين هذا الغشاء عند نموها في الوسط الزرعي السائل في الوقت الذي استطاعت فيه 85%من العزلات من تلزين كريات الدم الحمراء للانسان صنف O+ وذلك للتحري عن امتلاك البكتريا للواصق التي تمكنها من الالتصاق بمستقبلات خاصة مؤلفة من مواد كاربوهيدراتية تعرف باسم (Gal α1 - 4Gal ß )موجودة على سطح كريات الدم الحمراء للانسان ، كما واستخدمت العزلة (6¬MO¬)المشعرة والملزنة والعزلة (MO1)غير المشعرة والملزنة لمقارنة معدل التصاقها بالخلايا الطلائية للانسان والمرسبة من الادرار مع معدل التصاق العزلة (MPn6)غير المشعرة وغير الملزنة ,اذ بلغ معدل التصاق العزلة (6¬MO¬) 54.1 خلية بكتيرية /خلية طلائية اعلى من معدل التصاق العزلة MO1 والعزلة MPn6 التي بلغ معدل التصاقها (9.6 , 23.9 ) خلية بكتيرية / خلية طلائية على الترتيب . وفي محاولة للتعرف على انماط التلازن الدموي للعزلات البكتيرية قيد الدراسة ,اجري فحص التلازن الدموي لجميع العزلات البكتيرية (60 عزلة) باستخدام دم الانسان والابقار والدجاج وخنازير غينيا على الترتيب وقد ظهر النمط(RRRN) بكونه الاكثر سيادة حيث بلغت نسبته حوالي 33.3% من العزلات قيد الدراسة . تم اختيار احد العزلات (MO6) باعتبارها عزلة كفوءة ومشعرة لثبوتية صفاتها المستضدية واعطائها للنتائج القياسية المعروفة في التفاعلات الكيماحيوية لاستخدامها في التجارب اللاحقة المتمثلة باستخلاص مستضدات عوامل الالتصاق ( الشعيرات وبروتينات الغشاء الخارجي وعديد السكريد الشحمي ).المحور الثاني : استخلاص وتنقية المستضدات - تم استخلاص مستضد الشعيرات (Fimbriae) للعزلة المنتجة (MO6)باستخدام تقنية النبذ المركزي فائق السرعة لفصل الشعيرات وكذلك استخدام كبريتات الامونيوم بنسب تشبع مختلفة لغرض ترسيب البروتينات المستخلصة ، ومن ثم قدرت كمية البروتين في هذا المستخلص وكانت 0.525 ملغم /مل . - تم استخلاص بروتينات الغشاء الخارجي (OMPs) للعزلة MO6 باستخدام الانظيمات (RNase وDNase ) والمنظف N - Lauroyl - Sarcosinate كما وقدر تركيز البروتين في مستخلص OMPs النقي اذ بلغ 0.6 ملغم /مل ، اما متعدد السكريد الشحمي (LOS ) فقد تم استخلاصه بتكسير الخلايا بالانظيمات والاستخلاص بالفينول المائي الساخن ، وبعد فصل كل من الطورين المائي والفينولي تمت ازالة سمية LOS في كل من الطورين باستخدام مادة Hydrazine اللامائية .وكما تم تقدير كمية الكاربوهيدرات الكلية في الطورين المائي والفينولي كليهما ,حيث بلغت (300 , 190)مكغم/مل على التوالي ,فضلا عن قياس النسبة المئوية للبروتين المرتبط مع LOS في الطورين والتي بلغت (13.3 , 11.8) % على الترتيب. المحور الثالث : الدراسة المناعية شمل هذا المحور دراسة تاثير مستضد الشعيرات وبروتينات الغشاء الخارجي (OMPs) المنقاة جزئيا ومتعدد السكريد الشحمي (LOS) المزالة سميته والمستخلصة من العزلة الكفوءة (MO6)لبكتريا M.catarrhalis على الاستجابة المناعية ومعرفة دور هذه المستضدات الثلاثة في تنشيط او تثبيط فعالية بعض الخلايا المناعية ,ولغرض تحقيق ذلك اجريت الاختبارات المناعية الاتية في الزجاج (In vitro )والمتمثلة بعيوشية الخلايا البلعمية متعددة اشكال النوى والخلايا اللمفاوية والتشكل الزهري التائي والبائي وهجرة الخلايا البلعمية متعددة اشكال النوى (PMNs), فضلا عن عملية البلعمة للخميرة Candida albicans المقتولة بالحرارة.ادى استخدام تراكيز من مستضد الشعيرات (25 , 50 , 100 )مكغم/مل وتراكيزمن مستضد OMPs (50 , 100 , 200) مكغم/مل وتراكيز من مستضد LOS(200,100,50) مكغم /مل الى انخفاض معنوي (0.05 P <)في النسبة المئوية لعيوشية خلايا PMNs والخلايا اللمفاوية مقارنة بالسيطرة ,كما ادى استخدام التراكيز اعلاه ولكل المستضدات الثلاثة الى خفض معنوي في قطر منطقة الهجرة لخلايا PMNs . حيث كانت لجميع هذه التراكيز وللمستضدات الثلاثة تاثيرا مثبطا لهجرة خلايا PMNs وان تدرج التثبيط يزداد بصورة معنوية بزيادة تركيز المستضدات . اما فيما يخص عملية البلعمة التي استخدم فيها مستضد الشعيرات وOMPs وبالتراكيز (25 , 50 , 100 مكغم/مل) و(50 , 100 , 200 مكغم/مل) على التوالي , فقد لوحظ ازدياد معدل معامل البلعمة تدريجيا مع الزمن وبشكل معنوي (0.05 < P) حتى وصل اقصاه عند الوقت 90 دقيقة ، ثم انخفض بعد ذلك خلال الوقت 120 دقيقة ولجميع التراكيز المستعملة ولكلا المستضدين ، اما بالنسبة لمستضد LOS فقد لوحظ ان معدل معامل البلعمة يزداد وبصورة طفيفة وتدريجية واصبح بشكل معنوي عند الوقت 90 دقيقة من المعاملة ولجميع التراكيز المستعملة (200,100,50 ) مكغم /مل ,الا انه لم تظهر هنالك فروقات معنوية ( 0.05 P>) بين التركيزين (100 و200)مكغم /مل عند الاوقات (120,60,30) دقيقة ، كما وازدادت النسبة المئوية للخلايا اللمفاوية المكونة للتشكل الزهري التائي الفعال والكلي وكذلك التشكل الزهري البائي وبتاثير معنوي (< 0.05 P) للمستضدات الثلاثة (الشعيرات , OMPs ,LOS)عند التراكيز نفسها مقارنة مع معامل السيطرة . اوضحت نتائج تجربة تمنيع الحيوانات المختبرية (الارانب )بمستضد الشعيرات وOMPs وLOS والمعدل المناعي (Immunoferon) امكانية الحصول على اجسام مضادة للمستضدات المستخدمة والتي استدل على وجودها باستخدام اختبار الترسيب في الانابيب ,حيث ظهرت حلقة ترسيب في الانابيب الحاوية على مصل الارنب الممنع بهذه المستضدات والمعدل المناعي عند التراكيز( 140,50,200,100) مكغم/مل على الترتيب ، في حين لم يظهر اختبار الانتشار المناعي المزدوج في هلام الاكروز (اختبارOuchterlony) اي نتيجة موجبة عند استخدام تراكيز من مستضد الشعيرات وLOS وImmunoferon عدا مستضد OMPs حيث ظهر خط ترسيبي مفرد عند التركيز 200 مكغم /مل .وان هذه النتائج تشير الى امكانية استخدام هذه المستضدات كمعدلات مناعية لقابليتها على تحفيز الخلايا اللمفاوية البائية على تكوين | Sixteen isolate of Moraxella catarrhalis was diagnostic from a total of 344 pathogenic specimens , Moraxella catarrhalis was isolated and identified in a percentage of 17.4% .Isolates of M.catarrhalis were distributed amony source of the pathogenic specimens to (30,27.6,12.5,11.7,6.7) % for swabs from ear, nose, sputum specimens, pharynex, and tonsiles, respectively. Specimens were collected from male and female patients of different age groups referred to the Ear Nose & Throat and Chest consultants clinics in Al - Hakim general hospital in Najaf Governorate from the period of June, 2004 to December, 2004.Cultural, microscopical, and biochemical characteristics were considered for diagnosis of this bacteria, in addition to use of API - NH system.Higher incidence of bacteria was detected in women (18.8 %) compared to men (16.3%).Age group of (1 - 10) year was the dominant infected group (20.4%) among others .To investigate the nature of resistant to various antibiotics ,the isolates were subjected to the sensitivity test of 12 antibiotics which are routinely used in treatment of infections caused by this organism.All isolates were exhibited complete resistance (100 %) to Ampicillin, Amoxycillin, and Ttetracycline, moderatly resistant in a percentages of (73.3 ,71.7,66.7,61.7,60,58.3)% for each Cefotaxime, Ciprofloxaciy, Nitrofurantoin, Nalidixic acid, Cephalothin, Gentamycin, respectively. While, sensitive to Chloramphenicol ,Cephalexin ,Pipracillin when their resistance reached only ( 38.3 , 36.7 ,30)% ,respectively. All isolates exhibited multiple resistance for many antibiotic used in this study ,and 91.7% of isolates presented the ability to produce β - Lactamase enzyme .To investigate the pathogenicity factors for M. catarrhalis such as adhesion and colonization factors, all isolates showed the ability to produce CFA/I and CFA/III in apercentage of 93.3,96.7 %, respectively. Whereas, non of the isolates showed no ability to produce CFA/II .Twenty two (36.7 %) of M.catarrhalis isolates only were able to produce extracellular protease, but all isolates were unable to produce hemolycin, sidrophores, and capsule. To detect the ability of isolates to produce fimbriae ,pellicle formation test was done, and it was found that 80 % of isolates were formed this pellicle when it was grown in the broth culture media .At the same time ,85% of isolates were found to be able to cause agglutination of human blood type O+ “ in order to detect the precence of adhesion in the bacteria which make it able to attach into carbohydrate specific receptors named (Galα - 4Galβ)which presented on the surface of human blood erythrocyte” .The fimbriated –hemagglutinated isolate (MO6) and non fimbriated - hemagglutinated isolate(MO1) were used to compared the bacterial adherenc rate on human uroepithelial cells with non fimbriated –non hemagglutinated isolate(MPn6) .The adherence rate of (MO6) isolate was 54.1 bacterial cells / epithelial cell Morethan that of (MO1) and(MPn6) isolates which presented in 23.9 , 9.6 bacterial cells /epithelial cell,respectively . Hemagglutination patterns for all isolates were done by using human ,bovine ,chicken and guinea pig ,respectively in Hemagglutination test. RRRN patterns the highere incidence pattern presented in 33.3% from all isolates . One isolate (MO6) was selected to be used in the following experiment as it is considered efficient and fimbriated with consistent antigenic properties and its typical biochemical characteristics such as extraction of adherence factors antigens (fimbriae ,outer membrane proteins and lipooligosaccharide).Second Aspect : Extraction and Purification of Antigens. - Fimbria antigen was extracted from MO6 producted isolate by using ultracentrifugation and ammonium sulfate in a different saturation percentages for fimbriae separation and extracted protein precipitation ,respectively .The protein concentration in this antigen was estimated which was 0.525 mg/ml. - RNase ,DNase (enzymes)and N - lauroyl sarcosinate(Detergent) were used to extract OMPs ,from selected isolate (MO6).Protein concentration of the purified extracted OMPs was estimated and found to be 0.6 mg/ml. Lipooligosacchoride (LOS) was extracted after cells were broken by the above enzymes .The extraction was performed by hot - phenol .After the aqueous and phenolic phases were separated, it was detoxified for each phases by using anhydrous hydrazine, and total carbohydrate quantities were estimated for each phase which were 300,190µg/ml , respectively . Morever,LOS bounded protein quantity in each phase was also estimated. The percentages of the protein bounded to LOS for aqueous and phenolic phases were 13.3 , 11.8 %,respectively .Third Aspect : Immunological StudiesThis aspect was investigated the effect of fimbriae ,OMPs which are partially purified, and detoxified LOS antigens isolated from M. catarrhalis (MO6) on immunoresponse and showed the role of this three antigens in activation or inhibition of some immunocellular activity. The following (In vitro)immunological tests were performed; Viability of PMNs and lymphocyte, B and T rosette forming assay ,migration of PMNs, and phagocytosis of Candida albicans . The concentration of fimbriae (25,50,100) µg/ml , OMPs (50,100,200) µg/ml and LOS(50,100,200) µg/ml decreased the viability percentage of PMNs and lymphocyte with significant differences (P<0.05) in comparison to the control treatment ,while, these concentration for each antigens inhibited the migration of PMNs cells in asignificant differences and the gradual inhibition decreased significantly with increase of antigens concentration . The concentration of fimbriae ( 25 , 50 , 100) µg/ml and OMPs (50, 100 , 200 ) µg/ml increased the phagocytic index (PI) Significantly and gradually with time untile it reach the maximum at time 90 min. Then PI decrease at the time 120 minutes . For all concentration of each antigens LOS antigen increase the PI significantly at 90 min. for all concentration but its non significant (P>0.05) at times (30,60,120)minutes between (100,200) µg/ml concentration .All concentration used for these antigens (fimbriae ,OMPs ,LOS) increased the percentage of T and B rosette assay with high signfacant differences in comparison to control . The study showed that rabbit immunized by fimbriae ,OMPs,LOS, and Immunoferon produced antibodies against these antigens which were detected by Ouchterlony double diffusion test which showed no precipitin line between any antigens and serum of immunized rabbit except OMPs showed single precipitin line at concentration 200 μg/ml ,While there was clear ring of precipitin was formed in the second method (tube precipitation test) .These results showed the ability of these antigens to act as immunomodulators due to their ability to stimulate β - lymphocyte to produce antibodies similar to immunoferon
