انتاج انزيم الاميليز من بكتريا Bacillus licheniformis Bs7 وتقييد الخلايا المنتجة له بالاقتناص والامتزاز == Production of amylase from Bacillus licheniformis Bs7and immobilization of the producing cells by entrapment and adsorption
Author name:
مريم باسم انيس
Supervisor name:
سناء برهان الدين
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Bacteria
Degree:
Master
University:
University of Baghdad
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3156 - p.pdf
Abstract:
تم الحصول على 50 عزلة عائدة لجنس Bacillus من مصادر بيئية مختلفة شملت التربة ,الماء والغذاء. اختبرت قدرة هذه العزلات على انتاج انزيم الاميليز, وبينت نتائج الغربلة على ان العزلة Bacillus Bs7 المعزولة من التربة هي الاغرز انتاجا والتي شخصت على انها احدى سلالاتBacillus licheniformis.درست الظروف المؤثرة في انتاج الاميليز, ولوحظ ان اعلى انتاجية تكون عند زرع البكتريا في وسط S.Y.P. الحاوي على 1%نشا,0.2% مستخلص الخميرة, 0.5% ببتون, 0.4% كبريتات المغنيسيوم, 0.05% كلوريد الصوديوم و0.015% كلوريد الكاليسيوم, برقم هيدروجيني 7 وحضنها بدرجة حرارة 50م لمدة 48 ساعة في حاضنة هزازة بسرعة 150 دورة/دقيقة.رسب انزيم الاميليز بكبريتات الامونيوم بنسبة اشباع 70% وكانت الففعالية نوعية 540 وحدة/ملغم بروتين بعدد مرات تنقية 1.2وبحصيلة انزيمية مقدارها48%.تم تقييد خلايا B. licheniformis Bs7 وانزيم الاميليز المنقى جزئيا بتقنية الاقتناص (Entrapment) داخل الجينات الكاليسيوم والاكار وعديد الاكريلامايد وتبين ان الخلايا المقيدة داخل الجينات الكاليسيوم احتفظت ب110% من الفعالية الانزيمية بعد مرور 5 دقائق من زمن التفاعل يليها الاكار ثم عديد الاكريلامايد بفعالية متبقية 75%و 61% على التوالي مقارنة مع الخلايا الحرة التي امتلكت فعالية انزيمية 94% بعد مرور5 دقائق من زمن التفاعل كما احتفظت الخلايا المقيدة داخل الجينات الكاليسيوم ب 50% من فعاليتها الانزيمية بعد مرور 60 دقيقة من زمن التفاعل في حين احتفظت الخلايا الحرة ب 37% من فعاليتها بنفس الوقت. اما الانزيم المقيد داخل الجينات الكاليسيوم فقد احتفظ ب 85% من فعاليته الانزيمية بعد مرور 5 دقائق يليه الاكار 70% ثم عديد الاكريلامايد 50% مقارنة مع الانزيم الحر حيث احتفظ بفعالية انزيمية قدرها 79%.تم تقييد خلايا B. licheniformis Bs7 بطريقة الامتزاز (Adsorption) على السطوح الصلبة لمواد مختلفة شملت الفحم والقطن والنايلون ونشارة الخشب وعديد استارين والسيفاديكس G - 150, ثنائي اثيل امينو اثيل Sephadex - DEAE.احتفظت الخلايا المقيدة بنشارة الخشب باعلى فعالية انزيمية بلغت 128% عند حضنها بدرجة حرارة 50م لمدة 5 دقائق و79% عند حضنها لمدة 30 دقيقة بالمقارنة مع الخلايا الحرة والتي امتلكت فعالية انزيمية 87% و40% على التوالي في الظروف نفسها.وجد ان درجة الحرارة 50م هي الدرجة الحرارية التي تظهر اعلى فعالية الخلايا المقيدة بنشارة الخشب حيث احتفظت ب 125% من فعاليتها الانزيمية بعد مرور 5 دقائق مقارنة بالخلايا الحرة والتي امتلكت فعالية انزيمية 88% بعد مرور 5 دقائق.وعند تعرض الخلايا المقيدة بنشارة الخشب لدرجات حرارية مختلفة تراوحت بين 40 - 70 م لوحظ ان الخلايا المقيدة احتفظت ب 123% من فعاليتها بدرجة 60 م و97% بدرجة 70م في حين كانت هذه النسبة للخلايا الحرة 94% و70% على التوالي.وكان افضل رقم هيدروجيني للمحافظة على فعالية الخلايا المقيدة بنشارة الخشب هو 7 حيث بقت الخلايا المقيدة محتفظة ب 129% من فعاليتها في حين احتفظت الخلايا الحرة ب 90%.جرى استخدام الخلايا المقيدة بنشارة الخشب لثمان دورات. حيث لوحظ امكانية اعادة استخدام الخلايا المقيدة للدورات الثلاثة الاولى بفعالية متبقية مقدارها 95% و49% للدورات الثلاثة الاخرى وانخفضت الفعالية الى 30% في الدورة الثامنة.اختبرت قابلية الخلايا المقيدة بنشارة الخشب على ازالة البقع من الالبسة حيث لوحظ ان استخدام الخلايا المقيدة مع المنظفات افضل في ازالة البقع عن الالبسة من المنظفات لوحدها. | Fifty isolates belong to Bacillus spp. were isolated from different sources including soil, water and food. The ability of amylase production by these isolates was screened. Bacillus Bs7 which isolated from soil was the highest amylase producer; it was identified as a strain of Bacillus licheniformis. Optimal condition for α - amylase production were studied and the highest production of amylase was obtained when the bacteria were cultured in S.Y.P medium which contained 1% starch, 0.2% yeast extract, 0.5% peptone, 0.05% Mgso4 , 0.05% Nacl and 0.015% Cacl2 at pH 7 and incubated at 50˚C in shaking incubator at 150 rpm for 48hrs. Amylase was extracted by 70% ammonium sulphate precipitation and the specific activity was 849 u/mg protein. B. licheniformis Bs7 cells and partially purified amylase were immobilized by entrapment methods in calcium alginate, agar and polyacrylamide. The immobilized cells into calcium alginate retained 110% of enzyme activity after 5 minutes followed by agar and polyacrylamide with remaining activity 75% and 61%, respectively when compared with the free cells that have enzyme activity of 94% after the same time. Immobilized cells into calcium alginate retained 50% of enzyme activity after 60 min while free cells had remaining activityof 37% after the same time. Amylase that immobilized into calcium alginate retained 85% of enzyme activity after 5 min followed by agar and polyacrylamide that retained 70% and 50% of enzyme activity respectively, compared with the free enzyme with remaining activity of 79%. B. licheniformis Bs7 cells were immobilized by adsorption method on solid surfaces of different carriers including charcoal, cotton, nylon, sawdust, polystyrene, sephadex G - 150 and DEAE - sephadex. The immobilized cells on sawdust showed maximum enzyme activity of 128% when incubated at 50˚C for 5 min and 79% after 30 min incubation compared with free cells that showed 87% and 40% enzyme activity respectively at the same times. Optimum temperature for the activity of immobilized cells on sawdust was 50˚C which had 125% of enzyme activity after 5 min compared to free cells with remaining activity of 88% after the same time. Immobilized cells on sawdust when incubated at different temperatures ranged between 40 - 70˚C for 5 min, revealed that the immobilized cells had retained 123% of activity at 60˚C and 97% at 70˚C compared to the free cells which retained 94% and 70% at the two temperatures respectively. The optimum pH that kept the activity of immobilized cells on sawdust was 7 with remaining activity of 129% while free cells kept 90% of activity at this pH value. The immobilized cells on sawdust were repeatedly used for 8 cycles. The immobilized cells showed the maximum enzyme activity during the first three cycles with remaining activity of 95%, and 49% for the second three cycles; the remaining activity was reduced to 30% in eighth cycle. The ability of immobilized cells on sawdust to remove the stains from clothes was tested. The results showed that the ability of immobilized cells with detergents for removing stains was better than detergent alone.
