Share
التوصيف الجزيئي لذيفاني Panton Valentine leukocidine وExfoliatine في العزلات المحلية لبكتريا المكورات العنقودية المقاومة للمثسيللين == Molecular characterization of Panton Valentine leukocidine and Exfoliatine toxins in local isolates of Methicillin resistant Staphylococcus aureus
Author name:
رغد عبد اللطيف عبد الرزاق العبيدي
Supervisor name:
سوسن حسن عثمان كورجي | محمد فرج المرجاني
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Bacteria
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3273 - p.pdf
Abstract:
تم الحصول على 100 عزله تعود لبكتريا Staphylococcus aureus المقاومة للمثيسيللين من المرضى المصابين بالاصابات الجلديه المختلفة (52 عزله من الجروح)و(32 عزله من الخراج )و(16 عزله من الحروق) والوافدين الى مستشفيات ابن البلدي ومستشفى حماية الاطفال والجراحات التخصصيه ومستشفى الشهيد غازي الحريري ومستشفى بغداد التعليمي والمختبرات التعليميه في بغداد للفتره من ايلول ولغايه كانون الاول 2013. اختبرت حساسية جميع العزلات تجاه 13 مضادا حيويا مختلفا وقد اظهرت العزلات جميعها مقاومة لمضاد Cloxacillin بنسبة (100%) ، يليها المقاومة لمضاد Cefoxitin (86%) ومضاد Cephalexine ( 51% ) ، فيما كانت اقل نسبة مقاومة تجاه مضاد Teicoplanin ( %4). تم الكشف عن امتلاك العزلات لجينات pvl وeta وetb المشفرة لذيفانات Panton Valentine leukocidin وExfoliatin باستعمال تقنيه تضاعف البلمره المتسلسله PCR)) ، اظهرت النتائج امتلاك 27 عزله (27%) لجين pvl وامتلاك 13 عزلة (13%) لجين eta فيما لم تظهر اي عزلة امتلاكها لجين.etb 16 عزله منتجه لجين pvl وعزلتان منتجه لجين eta ارسلت الى NICEM/USA - machine is ABI3730XLAppliedBIOSYSTEM لتحديد تعاقب القواعد النتروجينيه لجين pvl وeta في عزلات بكتريا S. aureus وبعد تحليل النتائج وجد ان نسبة (58.44%) من الطفرات في الجين pvl الشريط R هي طفرات استبدال و(.66%37( طفرات حذف و.89%)3(طفرات ادخال بينما كان .21%)34( من الطفرات في الجين pvl الشريط F هي استبدال و.89%)57(طفرات حذف و(.89%7(طفرات ادخال. وفيما يخص الجين eta فكانت )100%) من الطفرات هي طفرات حذف لكل من eta - R وeta - F.. انتخبت العزله رقم ( 84 ) لاستخلاص وتنقيه ذيفان PVL ،وقد انتج الذيفان بعد مرور 24 ساعه من الزرع، رسب بعدها الذيفان باستعمال كبريتات الامونيوم (حد الاشباع 80%) ومن ثم التنقيه باستخدام عمود المبادل الايوني DEAE - cellulose بعدها عمود كروموتوغرافي الترشيح Sepharose 6B ومن ثم عمود كروماتوكرافي hydroxyl apatite الكاره للماء . قدر تركيز البروتين عند كل خطوه من خطوات التنقية وقد بلغ التركيزعند اخر خطوه من التنقيه.43 22 مايكروغرام /مل ،وصف الذيفانPVL وحدد الوزن الجزيئي له بواسطة هلام الترشيح sepharose 6B وباستخدام منحنى قياسي لعلاقة لوغارتم الوزن الجزيئي وخاصية Ve/Vo وبوجود محاليل البروتينات القياسيه، اذ حدد الوزن الجزيئي للذيفان فكان 35448دالتون . لوحظ النشاط السمي للذيفانPVL ضد كريات الدم البيضاء متعددة النوى بظهور الثقوب في هذه الخلايا وبعد فترات حضن مختلفه مع الذيفان عند تركيز 10 مايكروغرام /مل اذ ادى ازدياد التركيز الى تحطم الكريات متعددة النوى مما يشير الى موت الخلايا وتنخرها اعتمادا على تركيز الذيفان. حدد التاثير السمي الخلوي للذيفانPVL بتحديد الجرعة القاتله النصفيه 50% من الحيوانات المختبريه اذ ظهرت النتائج ان نسبة موت الفئران (50%)حدثت بعد مرور 24 ساعة وعند تركيز 10 مايكروغرام /مل .اظهرت الفحوصات النسجيه قدرة ذيفانPVLعلى احداث الاصابه في بعض اعضاء الفئران المصابه تجريبيا عندما حقنت الفئران البالغه في الصفاق بتراكيز الذيفان (5،10،15،20،22.43) مايكروغرام /مل .اخذت الاعضاء وعملت المقاطع النسجيه بعد ساعتين ثم بعد 24 ساعة وكذلك قتلت مجموعه من الفئران بعد 24 ساعه من التجريع الانفي بالذيفانPVL لتفحص بعدها الاعضاء نسيجيا.اثبتت نتيجه الفحص النسيجي للاعضاء ظهور تنخربانسجة الرئه وارتشاح الخلاياالالتهابيه وتنخرانسجه الكبد وتضخم بانسجة الطحال | One hundred isolates of Methicillin resistant Staphylococcus aureus were obtained from patients suffering from a variety of skin infections (52 isolates from wound ) , ( 32 isolates from abscess) and (16 isolates from burn), from patients at hospitals of Baghdad governorate included Ibn - El Balady, Martyr gazi Alhariry for specialized surgery hospital, Welfare teaching hospital, department of teaching laboratories and Baghdad teaching hospital at a period between September until November 2013 and were identified by morphological and biochemical tests , all of them were tested for their susceptibility to 13 of antibacterial agents, and all isolates were resistant to cloxacillin(100%) ,followed by cefoxitin (86%) and cephalexin (51 %), 26% to lincomycin, 24% to Azithromycine ,23% to trimethoprim and 22% to rifampicin,18% to gentamycin, 17% to vancomycin, ,13% to clindamycin and levofloxacine while the minimum resistance were seen with teicoplanin (4%).All isolates were detected for pvl,eta and etb by amplification of genes by PCR technique ,results showed that from 100 isolates ( 27%)Carry pvl gene,(13%) carry etA gene, while etB gene did not appear in any isolate.Polymerase chain reaction Product of pvl gene for sixteen isolates of S.aureus and two isolates of eta gene were sent to NICEM/USA - machine is ABI3730XLAppliedBIOSYSTEM to determine nucleotides sequencing and were achieved by using the applied biosystem (ABI) Capillary system, that mutation on pvl - R (58.44%) was subsititution mutation , (37.66%) was deletion and(3.89%) was insertion ,pvl - F (34.21%) was subsititution,( 57.89%) was deletion and(7.89%) insertion, on eta (100%) was deletion . One of pvl positive isolate (No.84) was selected for extraction and purification of Panton valentine leukocidin ,this toxin was produced after 24 hr of inoculation and it increased during the beginning of stationary phase .Panton valentine leukocidin toxin was precipitated by ammonium sulphate (80% saturation ) and purified using ion exchang byEDAE - cellulose, gel filtration chromatography by sepharose 6B, and hydro phobic interaction chromatography by hydroxyapatite. Protein concentration in each step of purification was determined ,protein concentration in the last step of purification was22.43µg/ml . PVL characterized , Mwt was determined by gel filtration sepharose 6B .The standard curve that represent the relationship between Log M.Wt and Ve/Vo for standard protein.The molecular weight of PVL toxin was determined as 35448 Da. The leukotoxic activities of PVL toxin was down by pore forming occurrence on PMNs after incubation with 10 µg/ml concentration PVL with in different incubation period ,when increase concentration lead toPMNs rupture Thus, the modes of cell death in vivo (necrosis versus apoptosis) may critically depend on the PVL concentration.Cytotoxicity of PVL was detected when determined the dose which cause death of 50% of laboratory animals. The result showed the death percentage of mice after 24hr were 10µg/ml.Histopathological investigations proved the ability of PVL toxin to cause the infections in the most organs of infected experimentally mice. Adult mice were injected intraperitonially with PVL at a different concentration (22.4, 20,10,5) g/ml. Histological sectioning of the organs was done after 2hr,24hr.also living mices were killed after 24hrs after endotracheal instillation with 20 g/ml PVL toxin.Histological examination were done for organs (liver, spleen and lung) .Results showed the existence of lesions and necrosis Damage and necrosis of aleveolar tissue ,odema, emphysematous chang chronic inflammatory cell infiltration and destruction in lung with degeneration and necrosis hepatic cell and spleen enlargement of white pulp with mild necrosis of parenchymal tissue
