First pages:

دراسة بكتريولوجية وخلوية لنماذج القشع لمرضى التهاب الجهاز التنفسي السفلي لدى المصابين وغير المصابين بسرطان الرئة == Bacteriological and Cytological Study for Sputum from Lower Respiratory Tract Infection in Both Lung Cancer and Non Lung Cancer Patients

Author name: عاصفة علي حسين الجنابي

Supervisor name: حسين حسن عمر خانقاه | علاء غني حسين

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تضمنت هذه الدراسة جمع (260 )نموذجا للقشع من المرضى البالغين المراجعين للعيادات الاستشارية والراقدين في كل من المستشفى الجامعي لكلية صدام الطبية ومعهد ومستشفى الطب والاشعاع النووي للفترة من ايلول 2001 ولغاية نيسان 2002 . وقد صنفت النماذج الى مجموعتين ، المجموعة (1) وتضم (210)مريضا مصابا بالتهابات القناة التنفسية السفلى من غير المصابين بسرطان الرئة ،تراوحت اعمارهم (14 - 85 ) سنة ، من بينهم (124)ذكورا ، و(68)اناثا. اما المجموعة (2) فتضم (50)مريضا مصابا بالتهابات القناة التنفسية السفلى من المشخصين بالاصابة بسرطان الرئة ،وقد تراوحت اعمارهم (40 - 80) سنة ،من بينهم (39)ذكورا ،(11) اناثا . 1 - اظهرت النتائج ارتفاع نسبة الاصابة لدى الذكور مقارنة بالاناث في كلتا المجموعتين (1) و(2) اذ بلغت (58.5%)،(76%)على التوالي ،في حين كانت الفئات العمرية المتقدمة اكثر عرضة للاصابة بهذه الالتهابات وفي كلتا المجموعتين .كما وجد ان نسبة المدخنين تفوق نسبة غير المدخنين في المجموعتين اذ بلغت (58.5%) في المجموعة (1)في حين بلغت (80 %)في المجموعة (2). 2 - عزلت البكتريا الهوائية واللاهوائية الاختيارية من نماذج القشع ، كما اجري الفحص المباشر لها باستخدام صبغة كرام والصبغة المقاومة للحامض A FB للتحري عن عصيات التدرن (T.B.).3 - تم تشخيص (129) نموذجا موجبا للزرع البكتريولوجي توزعت (95)نموذجا (2 .45% )في المجموعة (1)،و34 نموذجا (68 %) في المجموعة (2) ، في حين بلغ عدد النماذج التي لم تعزل فيها البكتريا المرضية (131)نموذجا ،توزعت (115 )نموذجا (54.7%) في المجموعة (1) ،16 نموذجا (32 %)في المجموعة (2) .بينما ظهر نمو مختلط في (13)نموذجا (13.6 %)في المجموعة (1) في حين بلغت 4 عينات (11.7 %) في المجموعة (2) .4 - اوضحت نتائج التشخيص البكتريولوجي للبكتريا المرضية المعزولة في المجموعة (1)،ان بكتريا S.pneumoniae كانت المسبب الاكثر شيوعا وبنسبة (51.4 %) تلتها بعض افراد العائلة المعوية (41.9 %)من بينها S. marcescens, E.cloacae ,K .pneumoniae وبنسبة عزل (7.4 %) ،(4.6 %) ، (2.8 %) على التوالي تلتها P. aeruginosa (13 %) تلتها S. aureus (11.2 %)، في حين تساوت نسبة عزل كل من M.catarrhalis , H.influenzae (4.6 %) لكل منهما .5 - اما البكتريا المرضية المعزولة في المجموعة (2) فكانت النسبة الاكبر لبكتريا S.pneumoniae 30 %تلتها بعض افراد العائلة المعوية 20 % من بينها S.marcescens ,E. cloacae ,K .pneumoniae وبنسب 12.5 % ،5 %،2.5 %على التوالي ، تلتها S.aureus 15 % تلتها نسب متساوية من P.aeruginosa, M.catarrhalis 12.5 % لكل منهما واخيرا H.influenzae 10%.6 - اما فيما يخص M.tuberculosis فقد اعتمد في تشخيصها على الفحص المجهري دون الزرع البكتريولوجي وكانت نسبة الفحص الموجب لمسحة القشع 11.6 % في المجموعة رقم (1) في حين لم تشخص اي نتيجة موجبة لتلك المسحة في المجموعة (2) .7 - اجري فحص الحساسية للعزلات البكتيرية المرضية تجاه 15 مضادا حيويا وهي (Ampicillin, Penicillin G, Cloxacillin, Co - Trimoxazole, Erthromycin , Tetracycline , Cephalexine, Ciprofloxacin, Cefotaxime, Lincomycin , Gentamicin, Pipracillin, Tobramycin, Ceftazidime, Amikacin) واظهرت النتائج وجود تباين واضح وبنسب مختلفة في مقاومة هذه العزلات للمضادات المستخدمة وللمجموعتين (1)،(2) .كما اظهرت العزلات البكتيرية في المجموعة (2) المصابين بسرطان الرئة مقاومة اعلى مقارنة بالعزلات البكتيرية في المجموعة (1) وقد اظهرت كل من S. pneumoniae ، S. aureus ، M. catarrhalis ، H. influenzae اعلى نسبة مقاومة تجاه الكلوكساسيلن والامبسيلين والبنسلين (ج) والتي بلغت 69.1% ، 64.8% ، 52.1% على التوالي في حين اقل نسبة مقاومة لهذه العزلات تجاه السبروفلوكساسين والسيفاتاكسين 4.2% و12.7% على التوالي ، اما P.aeruginosa ، K. pneumoniae ، E. cloacae ، S. marcescens فقد اظهرت اعلى نسبة مقاومة تجاه الامبسيلين والسيفالكسين ، والكوترايموكزازول 100% ، 90.7% ، 88.3% على التوالي بينما بلغت اقل نسبة مقاومة للمضادات الاميكاسين والسبروفلوكساسين والسيفاتاكسيم 14% ، 20.9% ، 37.2% على التوالي .8 - تم تحديد قيم التراكيز المثبطة الدنيا MIC لبعض العزلات البكتيرية تجاه ثمانية مضادات (الامبسلين ، السيفاتاكسيم ،السيفتازديم ،البنسلين ،الببراسلين ،السبروفلوكساسين ،الارثرومايسين ،الجنتاميسين) وقد تباينت قيم MIC لهذه المضادات تجاه العزلات البكتيرية، اذ ابدت كل من M.catarrhalis ,S.aureus, S. pneumoniae اعلى مدى للمقاومة تجاه مضادات الامبسلين ،البنسلين ،السيفاتاكسيم ،اما البكتريا العصوية السالبة لكرام P.aeruginosa ,S.marcescens, E.cloacae ,K.pneumoniae فكان اعلى مدى للمقاومة تجاه الببراسلين والجنتاميسين في حين كان اقل مدى للمقاومة للعزلات البكتيرية كافة لمضاد السبروفلوكساسين .9 - اختبرت العزلات البكتيرية المقاومة لمجموعة البيتالاكتام ومنها (الامبسلين ،الببراسلين ،السيفتازديم) وقد حددت قيم MIC لها بوجود مثبطات انزيمات البيتالاكتاميز ومنها مثبط حامض الكلافيولنك وبطريقة النسبة الثابتة 2 : 1 لخليط المثبط /المضاد على التوالي ،كما استخدام مثبط التازوباكتم مع الببراسلين المحضر تجاريا بنسبة 8 : 1 على التوالي . وقد اظهرت النتائج ان استخدام مثل هذه المثبطات اعطى فعالية عالية واسترجع المضاد لكفاءته للقسم الاكبر من العزلات المقاومة.وقد ابدى خليط التازوباكتم / الببراسلين افضل تاثير تازري اذ بلغت نسبة حساسية الخليط 76.9 %، كما وجد ان بان هذا الخليط ذو فعالية تفوق خليط حامض الكلافيولنك /الببراسلين .10 - بينت الدراسة الخلوية لكافة النماذج قيد الدراسة وجود الخلايا الالتهابية (الحادة غالبا ) كما لوحظ وجود التغيرات الخلوية السابقة لحدوث السرطان (خلايا التنسج الحرشفي والحثل النموي بمختلف درجاته )في كلتا المجموعتين فضلا عن وجود الخلايا السرطانية في مجموعة المصابين بسرطان الرئة . وقد بلغت نسبة خلايا التنسج الحرشفي في المجموعة (1)و(2) 37.1 %، 34 % على التوالي في حين نسبة وجود خلايا التنسج الحرشفي والحثل النموي للمجموعتين (1)و(2) قد بلغت 10.5 % ،26 % على التوالي . كما وجد ان نسبة التغيرات الخلوية اعلى في الفئات العمرية المتقدمة لاسيما لدى المدخنين اذ بلغت 74.3 %، 90.9 % للمجموعتين (1) ،(2) على التوالي .11 - كما اظهرت نتائج الفحص الخلوي لقشع المرضى المشخصين بالاصابة بسرطان الرئة سيادة لنوع السرطان الحرشفي من بين انواع السرطان الرئوي وبنسبة 50 % تلتها السرطان الغدي 14 % ثم السرطان ذو الخلايا الصغيرة 10 % وان نسبة 26 % كانت للنماذج التي لم يشخص فيها نوع السرطان الرئوي بالفحص الخلوي . | This study included collection of 260 sputum samples from adult patients referred to the outpatient clinic and admitted to both Saddam College of Medicine University Hospital and Institute of Nuclear Medicine from the period September 2001 till April 2002.The samples were classified into two groups : The first group included 210 patients , ranged (14 - 85) years old : 124 males and 86 females , with lower respiratory tract infections with no history of lung cancer and the second group include 50 patients having lower resporatory tract infections who are known cases of lung cancer, their age range from (40 - 80) years; 39 males and 11 females.1 - The results reveal higher incidence of lower respiratory tract infection in males than in females in both groups since it was 85.5%, 76% in the two groups respectively. There were a high incidence of lower respiratory tract infection with increasing age in the two groups of patients. Also it was found that incidence of smokers was higher than non - smoker in the 2 groups studied since it was 58.5% in the first groups and 80% in the 2nd group.2 - Isolated aerobic and faculative anaerobic bacteria and they were stained by Gram stain and acid - fast stain (AFB) examined . 3 - There was 129 positive sample for bacteriology culture divided into 95 sample 45.2% in the first group, 34 sample 68% in the 2nd group whereas 13 sample were negative for pathogenic bacterial growth, divided into 115 sample 54.7% in the 1st group 16 sample 32% in the 2nd group. Mixed bacterial growth was noticed in 31 sample 13.6% in the first group while 4 samples 11.7 in the 2nd group.4 - Results of bacterial diagnosis reveal species and percentage of bacteria isolated from first group that S.pneumoniae was the major and the commonest cause of LRT1 51.4% followed by some enteric group 41.9% including : K.pneumoniae, E.cloacae, S.marceseens with percentage of isolates : 7.4%, 4.6%, 2.8% respectively, followed by P.aeruginosa which constitute 13%; than S. aureus 11.2% while equal percentage of isolates from both H influenzae and M. catarrhalis 4.6% for each.5 - For the lung cancer patients groups the predominant bacterial growth was for S.pneumoniae 30% followed by some entric group 20% including K.pnumoniae, E. cloacae, S.marcescens with percentage of isolates 12.5%, 5%, 2.5% respectively. Bacteria S. aureus comes next 15% of isolate, followed by P. aeruginosa and M. caqtarrhalis 12.5% for each and H. influenzae comes at the end of the list 10%.6 - For the dinguses of M. tuberculosis we depended on microscopical examination without bacteriological culture , the positive percentage of sputum smear was 11.6% in group (1) while we can not diagnosis any positive result in group (2). 7 - Antibiotic sensitivity test was doing for all the pathogenic bacterial isolates to 15 antibiotic that were Ampicillin, Penicillin G, Cloxacillin, Co - Trimoxazole, Erthromycin , Tetracycline , Cephalexine, Ciprofloxacin, Cefotaxime, Lincomycin , Gentamicin, Pipracillin, Tobramycin, Ceftazidime, Amikacin the results reveal a clear variation in antibiotic sensitivity among different bacterial isolates for both groups. Also the bacterial isolates for the lung cancer group have shown higher antibiotic resistance than the isolates for the first group in general . S. pneumoniae , S. aureus , M. catarrhalis , H. influenzea show highest resistance percentage toward cloxacillin, ampicillin, pencillin G , 69.1%, 64.8%, 52.1% respectively while the lowest resistant percentage for this isolate for ciprofloxacin , cefetoxime 4.2% , 12.7% respectively . While P. aeruginosa, K. pneumoniae , E. cloacae , S. marcescens it show highest resistant percentage for ampicillin, cephalexine , co - trimoxazole 100%, 90.7% , 88.3% respectively . While the lowest resistance percentage for the antibiotic amikacin, ciprofloxacin , cefotaxime 14%, 20.9%, 37.2% respectively .8 - Results of MIC were determined for some bacterial isolates towards eight antibiotic (Ampicillin, cefotaxime, cefazidime, penicillin, pipracillin, ciprofloxacin, erythromycin, gentamicin). And reveal a marke of variation among MIC values for different regard, S. pneumoniae, S. aureus and M. catarrhalis have shown the highest range of resistance towards Ampicillin , penicillin, cefotaxime while the Gram negative bacillius (K. pneumoniae, E. cloacae, S. marcescens, P. aeoginisa) have shown a high range of resistance towards pipracillin , gentamicin. Most of bacteria isolates showed little resistance toward ciprofloxacin.9 - Bacterial isolates that revaled resistance to betalactm group (Ampicillin, pipracillin, ceftazidine) were tested for MIC values in the presence of beta lactamases inhibitors including clavulanic acid in a ratio of 2 : 1 for antibiotic inhibitor respectively. Also tazobactam inhibitor was mixed with pipercillin prepared commercially with 8 : 1 respectively. And the results revealed that the use of such inhibitors gives higher activity and made the antibiotic retain its effectiveness for a large portion of resistance bacterial isolates. The Tazobactam / piperacillin mixture have shown the best synergestic effect since its sensitivity reach 76.9%. Also found that this mixture was of activity that exceed calvulanic acid/ piperacillin mixture.10 - Cytological study of sputum samples explain in both groups have revealed the presence of inflammatory cells (predominantly acute). Also it reveals the presence of precancer cytological changes including squamous metaplasia and different graded of dysplasia cellular a typical in both group studied. Also it reveals presence of cancer cell in lung cancer group.Squamous metaplsia changes occur in the non lung cancer group 37% and 34% in the lung cancer group. Combined squamous metaplsia and dysplasia was seen in 10.5% in the 1st group and 26% in the 2nd group. Also the incidence of precancers cellular changes (including squamous metaplasia and dysplasia) were noticed with advanced age especially among smokers 74.3%. 90.9% for the 1st and 2nd group respectively.11 - Also sputum cytology examination for lung cancer patients revealed predominant of squamous cell carcinoma variety 50% followed by adenocarcinoma group, the small cell carcinoma group 10% and 26% of cases the exact cancer subtype was not determined by sputum cytological examination.

دراسة وراثية وجزيئية لعزلات محلية مرضية من بكتريا Klebsiella المقاومة للمعادن الثقيلة والمنتجة لانزيم B - Lactamase == A Genetic and Molecular Study of Local Pathological Isolates from Klebsiella Resistant to Heavy Metal and Productive of ? - Lactamase Enzymes

Author name: صلاح مهدي حسن السعدون

Supervisor name: سوسن ساجد محمد علي الجبوري | نزار ادور ناصر

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تضمنت هذه الدراسة جمع (536) عينة ادرار من مرضى يعانون من التهاب المجاري البولية من اربعة مستشفيات في بغداد للفترة الواقعة من 22/12/2004 - 27/5/2005.2 - من خلال نتائج الزرع البكتريولوجي الاولي استطاعت (286) عزلة (63.8%) من النمو باستخدام وسطي اكار الماكونكي واكار الدم وقد كان من بينها (85) عزلة مخاطية وبنسبة (29.7%)، فيما اظهرت نتائج التشخيص المورفولوجي والكيموحيوي للعزلات المخاطية ومن خلال نتائج استخدام نظام Api 20E عائدية (36) عزلة الى جنس الكلبسيلا، توزعت مابين (18) عزلة للنوع K.planticola K.pneumoniae و(7) و(6) عزلات للنوع عزلات للنوع K.terrigena و(4) عزلات للنوع K.oxytoca و(1) عزلة للنوع K.ornithinolytica. 3 - تم التحري عن عدد من عوامل الضراوة لانواع الكلبسيلا، اذ اظهرت نتائج الفحص المجهري باستعمال طريقة التصبيغ السالب ان العزلات جميعها (100%) محاطة بمحفظة، كما بينت جميع العزلات (100%) عدم قدرتها على انتاج الهيمولايسين، بينما اظهرت (61.1%) من العزلات قدرتها على انتاج السايدروفورات بنموها في الوسط الحاوي 2 - 2 ثنائي بايريديل (M9)، واظهرت جميع العزلات ايضا (100%) قابلية الالتصاق بالخلايا الطلائية المعزولة من ادرار اناث صحيحات، فيما كان (66.6%) من العزلات منتجة للبكتريوسين.4 - اختبرت قابلية العزلات على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز باستخدام الطريقة اليود القياسية السريعة، اذ اظهرت (23) عزلة (63.8%) قدرتها على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز بهذه الطريقة، بفترات تراوحت مابين اقل من دقيقة الى (5) دقائق.5 - اختبرت قابلية العزلات على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف باستخدام الطريقة الثلاثية الابعاد (غير المباشرة)، واظهرت النتائج بان 18 عزلة من مجموع 36 (33.3%) لها القدرة على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف توزعت مابين 5 عزلات من مجموع 18 (27.7%) للنوع K.planticola و3 عزلات من مجموع 6 (50%) للنوع K.pneumoniae وعزلتان من مجموع 7 (28.5%) للنوع K.terrigena وعزلة واحدة من مجموع 4 (25%) للنوع K.oxytoca وعزلة واحدة فقط من مجموع 1 (100%) للنوع K.ornithinolytica.6 - اجري اختبار الحساسية للمضادات لجميع العزلات تجاه (24) مضادا للحياة، لقد اظهرت جميع العزلات نمط المقاومة المتعددة، اذ كانت (100%) من العزلات مقاومة للامبسلين والكاربنسلين والببراسلين والسيفالوكسين، بينما كانت العزلات جميعها حساسة للاميكاسين والسفيبيم والاميبينيم والنورفلوكساسين، فيما تفاوتت نسب المقاومة لباقي المضادات.7 - حددت التراكيز المثبطة الدنيا لعدد من البنسلينات والسيفالوسبورينات ومجموعة الامينوكلايكوسيدات والكينولونات وغيرها من المضادات، واظهرت النتائج ان هنالك اختلافا واضحا في قيم الـMIC بين الانواع البكتيرية المختلفة سيما المنتجة لانزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف، فقد استطاعت اغلب العزلات مقاومة تراكيز عالية من الامبسلين، والكاربنسلين والببراسلين والسسيفالكسين غير انه لم تستطع سوى عزلات قليلة وبضمنها المنتجة لانزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف من النمو في تراكيز عالية من الاميكاسين (AK)، والسيفيبيم (PEF)، والامبينيم (IMP)، والنورفلكساسين (NX)، والسيروفلكساسين (CF).8 - درست قابلية العزلات على تحمل تراكيز مختلفة من المعادن الثقيلة وذلك بانمائها على اوساط ضمت تراكيز مختلفة من تلك المعادن. وقد اظهرت النتائج انخفاضا في مستوى تحمل البكتريا للمعادن الثقيلة، وكان هنالك اختلافا واضحا من بين تلك العزلات لتحمل معدن النحاس، الكروم، الكوبلت، الزنك، الكادميوم، الزئبق، الرصاص، الفضة. 9 - تمت دراسة محتوى الدنا البلازميدي لمجموعة من العزلات والتي اظهرت مديات عالية من المقاومة لمضادات الحياة والمعادن الثقيلة، وبينت النتائج احتواء معظم العزلات على اكثر من حزمة بلازميدية واحدة، بينما خلت بعض العزل من اي حزم وبذلك تصبح مقاومة للمضادات والمعادن الثقيلة فضلا عن انتاج انزيمات البيتالاكتاميز صفة الكروموسومية.10 - اجري فحص الاقتران البكتيري مابين عزلات منتقاة من انواع بكتريا الكلبسيلا اتسمت بمقاومتها العالية الى اكثر من مضاد وتحملها للمعادن الثقيلة فضلا عن انتاجها لانزيمات البيتالاكتاميز وبين السلالة القياسية E.coli MM294، وقد استطاعت 9 عزلات من مجموع 14 عزلة تحقيق عملية الاقتران بنجاح (وبنسبة 64.2%) فيما اخفقت 5 عزلات، واستطاعت الخلايا الاقترانية الناتجة من التزاوج من النمو على اوساط الاختبار الحاوية على مضادي الامبسلين والريفامبسين معا. 11 - تم التحري عن المحتوى البلازميدي للخلايا الاقترانية ووجد ان اغلب البلازميدات كانت قد انتقلت من السلالة الواهبة متمثلة بالعزلات قيد الدراسة الى السلالة القياسية، اذ استطاعت 7 عزلات اقترانية من مجموع 9 وبنسبة (77.7%) من اعطاء فحص انزيم البيتالاكتاميز موجب ونسبة (77.7%) لفحص التحري عن ESBLs. فضلا عن ذلك فقد انتقلت مقاومة مشتركة لاكثر من مضاد حيوي ومعدن ثقيل للخلايا الاقترانية مما يدل على ان هذه الصفات محمولة بلازميديا. | 1 - This study included the collection of 536 urine samples from patients suffering urinary tract infection from four hospitals located in Baghdad to the period between 22/12/2004 - 27/5/2005. 2 - Using MacConkey blood agar in primary bacterialogical culture, 286 isolates (63.84) were grown, among them 85 isolate (29.71) were mucoid. Result of morphological & Biochemical diagnosis besid using Api 20E showed there were 36 isolates related to genus Klebsiella. These comrised as K.planticola (18 isolates), K.terrigena (7 isolets) and K.pneumonia (6 isolates) & K.oxytoca (4 isolates) and one isolates of K.ornithinolytica. 3 - Some virulence factors of Klebsiella species were detected. Microscopic examination using negative stain revealed that all the isolates (100%) were capsulated, besid they were unable to produce heamolysine. While (16.1%) of the isolate were siderophore producer when they showed their ability to grow in 2 - 2 dipyridyl media (9M media). All the isolates (100%) showed adherence ability to epithelial cell isolated from urine of healthy women, whereas 66.6% of the isolates were bacteriocin producer. 4 - The rapid standard iodometric method was used for the dection of B - lactamase production. Results showed that 23 isolate (63.84) were B - lactamase producer and the time of positive results ranged from less than (1 - 5)mins. 5 - The indirect three - dimentional method was performed to detect the Extended - spectrum B - lacatamase (ESBLs). Results revealed that only 18 isolates (33.3%) were ESBLs producer. These comprised 5 isolated from 18 (27.7) to K.planticola, 3 isolates from 6 (50%) to K.pneumonia, 2 isolates from 7 (28.5%) to K.terrigena, one isolates from 4 (28%) to K.oxytoca & one isolate (100%) to K.ornithinolytica. 6 - Antibiotic sensitivity test was performed using 24 different antibiotic. All isolates showed multidrug resistance. Results showed that all the isolate (100%) were able to resist Ampicillin, Carbencillin, Piperacillin, Cephalexin, while they were sensitive towards Amikacin, Cefepime, Imepinem and Norflaxacin. Resistance rate to other antibiotic were variant. 7 - The minimal inhibitory concentration (MIC) for Penicillins & Cephalosporins, Aminoglycoside group, Qinolones & other antibiotics were determined. Considerable differences observed between the MIC for ESBLs producer isolates and the non - producer - both groups were able to resist high concentration of Ampicillin, Carbenicillin, Piperacillin & Cephalexin while only the ESBLs producer outcome of non - producer isolates were able to grow in considerable concentration of Amikacin, Cefepime, Imepinem, Norflaxacin & Ceprofloxacin. 8 - The ability to tolerate different concentration of heavy metals were studied by growing them in media containing different concentration of these metals. There were great differences & decreas & in the level of bacterial tolerance to heavy metals including (Cu, Cr, Co, Zn, Cd, Hg, Pb, Ag) while many isolates could not tolerate low concentration of copper nor chrome. 9 - Plasmid profile of some isolated specially these showed high antibiotic & heavy metal resistance were determined. Result showed that most of the isolates examined harboured more than one plasmid band. While some isolates were plasmidless, A condition implying that B - lactamase production, antibiotic & heavy metal resistance are under chromosomal control. 10 - Bacterial conjugation was performed between selected isolates of Klebsiella specially those with high antibiotic resistance, heavy metal tolerance, besid B - lactamase production and the standard strain E.coli MM294. There were (9) successful conjugation from 14 (64.2%). The transconjugant cells were able to grow of selective media containing both of Ampicillin & Rifampicin. 11 - Studying plasmid profile of transconjugated cells showed that most the plasmid were transferred from the donore (represented by bacterial isolated) to recipient (the stander stranted). Out of 9, 7 transconjugant cells (77.7%) gave positive result to B - lactamase production & ESBLs. In addition multidrug resistance & heavy metal tolerance were transferred to the transconjugant cells, a condition implying that they are plasmid mediated.

تاثير التطفير الفيزيائي على قابلية بكتريا Staphylococcus aureus في انتاج انزيم الستافلوكاينيز واستنساله في بكتريا Escherichia coli == Effect of physical mutagenesis on the ability of Staphylococcus aureus in staphylokinase production and its cloning in Escherichia coli

Author name: علاء سالم حمزة

Supervisor name: رياض عبد الحسين دلول | حميد مجيد جاسم

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Doctorate

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: هدفت الدراسة الى استنسال جين الستافلوكاينيز من بكتريا Staphylococcus aureus المعزولة محليا في بكتريا Escherichia coli والتحري عن التعبير الجيني في المضيف الجديد فضلا عن دراسة بعض الظروف المثلى المؤثرة في ذلك التعبير . جمعت 200 عينة سريرية من اصابات المجاري البولية والاصابات الجلدية من بعض المستشفيات في محافظة بغداد . وقد تم الحصول من تلك العينات على 54 عزلة بكتيرية وشخصت على انها S.aureus وفقا لخصائصها المظهرية ونتائج الاختبارات الكيموحيوية . وقد تم تاكيد تشخيص تلك العزلات باستخدام نظام Viteck - 2 التشخيصي . تم دراسة قابلية عزلات بكتريا S.aureus في انتاج انزيم الستافلوكاينيز وفعاليته التحليلية على وسط بلازما الدم المتصلب بمادة الاكار . وقد اشارت النتائج الى ان جميع العزلات البكتيرية كانت منتجة وبدرجات متفاوتة لانزيم الستافلوكاينيز . وقد تميزت العزلة البكتيرية S.aureus A15 المعزولة من اصابات الجلد بكفائتها العالية في انتاج الانزيم لكون رائق مزرعتها ادى الى تكوين اعلى قطر هالة تحلل مقداره 36 ملم على وسط بلازما الدم المتصلب بمادة الاكار . ولاجل تحسين قابلية العزلةA15 S.aureus في انتاج انزيم الستافلوكاينيز ، فقد تم تعريض هذه العزلة للتطفير العشوائي باستخدام الاشعة فوق البنفسجية لحث الطفرات الوراثية التي تحور ايجابيا انتاجيتها من انزيم الستافلوكاينيز . وقد اشارت النتائج الى انه قد تم الحصول على طافرتين بكتيريتين لهذه العزلة ازدادت قابليتهما على انتاج الانزيم على ضوء زيادة قطر منطقة التحلل الى 38 ملم مقارنة بالنوع البري . اجري استنسال جين الستافلوكاينيز في بكتريا E.coli JM 109(DE3) وذلك باستخلاص الدنا الجيني اولا من الطافرة S.aureus A15 - M1 بطريقة الغليان ثم الحصول على الدنا بتركيز 50 مايكروغرام / مل وبنقاوة وصلت الى 1,8 . تم بعدها تضخيم جين الستافلوكاينيز باستخدام بادئات نيوكليوتيدية متخصصة لتضخيم اطار القراءة المفتوح (Open reading frame) للجين التركيبي . وقد اشارت نتائج التضخيم الى انه قد تم الحصول على قطعة دنا بحجم 400 زوج قاعدي . تم تحديد التعاقب النيوكليوتيدي لجين الستافلوكاينيز وقد اشارت النتائج الى وجود ثلاث طفرات نقطية (Point mutations) في الجين التركيبي للستافلوكاينز على اساس مقارنة الترتيب النيوكليوتيدي للجين مع الترتيب النيوكليوتيدي لنفس الجين للسلالة القياسية S.aureus المسجلة في قاعدة البيانات BLAST/ NCBI . وقد كانت هذه الطفرات من نوع missens mutations التي لم تؤثر على المجموعة التي ينتمي اليها الحامض الاميني المتغير ولم تؤثر على فعالية الانزيم . وقد اشارت النتائج ايضا الى عدم احتواء التعاقب النيوكليوتيدي للجين على اي موضع حساس لانزيمي التقييد BamHI وXbaI والتي استخدمت فيما بعد لكلونة الجين بالهضم المزدوج بهذين الانزيمين للحصول على قطعة تقييد ذات نهايات لاصقة من نوع BamHI وXbaIالناشئة عن مواضع التقييد الحساسة لهذين الانزمين ضمن التعاقب النيوكليوتيدي للبادئات النبوكليوتيدية المتخصصة المصممة لهذا الغرض (البادىء النيوكليوتيدي الامامي المتضمن موقع تقييد لانزيم BamHI والبادىء النيوكليوتيدي الخلفي المتضمن موضع تقييد لانزيم XbaI) ، ثم لحم قطعة تقييد جين الستافلوكاينيز مع ناقل الكلونة pSP72 المهضوم مسبقا هضما مزدوجا بانزيمي التقييد BamHI وXbaI للحصول على جزيئة ناقل ذات نهايات لاصقة متوافقة مع النهايات اللاصقة لجين الستافلوكاينيز . وبعد اللحم تم اجراء عملية الترحيل الكهربائي للناقل الهجين (جزيئة الناقل الحاوية على جين الستافلوكاينيز) على هلام الاكاروز (1%) . وقد اشارت نتائج الترحيل الكهربائي الى ظهور حزمة دنا تمثل الناقل الهجين بحجم كلي مقداره 2900 زوج قاعدي . وفي الخطوة اللاحقة من تجربة الاستنسال فقد استخدم الناقل الهجين لتحول بكتريا E.coli JM109(DE3) المؤهلة كمضيف جديد امن للجينات الغريبة القادمة من مختلف الكائنات الحية . وقد تم انتقاء المتحولات المرغوبة لبكتريا E.coli الحاوية على الناقل الهجين على وسط البلازما المتصلب بمادة الاكار الحاوي على المضاد الحيوي الامبسيلين بتركيز 50 مايكروغرام/ مل كصفة انتقائية للوسط . وقد اشارت نتائج التحول الى الحصول على خمسة متحولات بكتيرية من بكتريا E.coli JM109(DE3) القادرة على النمو بوجود الامبسيلين والمنتجة لانزيم الستافلوكاينيز المحلل لمادة البلازما في الوسط . وقد كانت درجة التعبير الجيني لجين الستافلوكاينيز في المضيف الجديد مقاربة لدرجة تعبير نفس الجين في المضيف الاصلي S.aureus . درست بعض الظروف المثلى لتعبير جين الستافلوكاينيز في بكتريا E.coli المهندسة وراثيا . وقد اشارت النتائج الى ان درجة التعبير الجيني في المضيف الجديد قد ازدادت بتنمية البكتريا في وسط لوريا - بيرتاني المتصلب بمادة الاكار الحاوي على مادة IPTG (كمحفز للتعبير الجيني) بتركيز 100 مايكروغرام / مل . كما درس تاثير درجة الحرارة على فعالية الانزيم واظهرت النتائج ان افضل درجة حرارة لفعالية الانزيم كانت °C 37 لمدة 24 ساعة . | This study was aimed for cloning staphylokinase gene from locally isolated Staphylococcus aureus in Escherichia coli and detection the gene expression in new host in addition to determine some of the optimum conditions for gene expression. A total of 200 clinical samples from urinary tract and skin infections were collected from some hospitals in Baghdad . from these samples,54 bacterial isolate were obtained and identified as S.aureus according to their cultural and morphological characteristics and results of biochemical tests . Identification of these isolates was confirmed by using VITECK - 2 identification system. Ability of S.aureus isolates in staphylokinase production and thrombolytic activity of this enzyme was screened on human plasma agar medium, and it was found that all bacterial isolates were able to produce staphylokinase with variable degrees. Among these isolates S.aureus A15 isolated from skin infection was the most efficient isolate in staphylokinase production because its culture filtrate causing highest zone of hydrolysis (36 mm) on plasma agar medium in comparison with other isolates. In order to enhance the ability of S.aureus A15 in staphylokinase production, this isolate was subjected to random mutagenesis by using UV - irradiation to induce genetic mutations altered positively staphylokinase production by this isolate. Results showed that two mutants of S.aureus A15 obtained after UV - irradiation were increased in its ability in staphylokinase production according to the increase of the diameters of hydrolysis zones to 37 mm and 38 mm in camparison with the wild - type. Cloning of staphylokinase (sak) gene in E.coli JM109 (DE3) was achieved first by extraction of S.aureus A15 - M1 genomic DNA by using boiling method with DNA purity and concentration of 1.8 and 50 μg / ml respectively . Then Sak gene was amplified by using specific primers for gene open reading frame (Structural gene) . Results showed that the amplification product was a fragment of DNA with size of about 400 bp. Amplified sak gene was then sequenced to determine the nucleotide sequence of the gene . Results of sequencing showed that there are three point mutation were occurred in the structural gene of staphylokinase according to base pair alignment with the same gene of S.aureus standard strain recorded in BLAST / NCBI. These mutations are missens mutations doesn’t affect the group of amino acid that was changed then doesn’t affect enzyme activity. Results of sequencing also showed that the complete nucleotide sequence of the gene doesn’t have a restriction site for BamHI and XbaI that were used later for gene cloning by double digestion of the gene with these two enzymes to obtain restriction fragment with sticky ends of BamHI and XbaI that were came from the restriction sites for these two enzymes within the specific primers designed for this purpose (forward primer containing restriction site for BamHI and reverse primer containing restriction site for XbaI). Then the restriction fragment of staphylokinase gene was ligated with pSP72 cloning vector previously double digested with BamHI and XbaI to get vector molecule with sticky ends compatible with the two sticky ends of Sak gene, then recombinant vector was analyzed on agarose gel (1%) . Results of electrophoresis showed that there was a single DNA band represents the recombinant vector with a total size of 2900bp. In the next step of cloning experiment , recombinant pSP72 was used to transform competent E.coli JM 109 (DE3) as a new and safe host for foreign genes came from different organisms . Then positive transformants of E.coli (containing recombinant pSP72) was selected on plasma agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin as a selectable marker. Results of transformation showed that there are five transformants of E.coli JM 109 (DE3) were able to grow in presence of ampicillin and producing staphylokinase enzyme that was able to hydrolyse human plasma in the agar medium . The degree of staphylokinase gene expression in the new host (E.coli) was asymbtotic to the degree of expression of the same gene in the original host (S.aureus) . Optimum conditions for staphylokinase gene expression in genetically engineered E.coli was studied under two growth factors . Results of optimization showed that the degree of gene expression in new host was increased when transformant E.coli JM 109 (DE3) was grown in Luria - Bertani agar containing IPTG (as inducer for gene expression) in a concentration of 100 μg / ml and incubated at 37 ⁰C for 24 hours . Effect of incubation temperature on staphylokinase activity produced by genetically engineered E.coli JM 109 (DE3) transformant was studied in range of temperature. Results showed that the optimum temperature for staphylokinase activity was 37 °C , at this temperature the diameter of zone of hydrolysis was 30mm , while the enzyme activity was decreased above and under this temperature .

دراسة وراثية للبكتريوسين المنتج من بكتريا Klebsiella spp. المعزولة من مصادر سريرية مختلفة

Author name: علاء سالم حمزة حبيب

Supervisor name: رياض عبد الحسين دلول

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تضمنت الدراسة جمع (200) عينة سريرية توزعت الى (50) عينة ادرار و(50) عينة قشع و(50) عينة من التهابات الاذن الوسطى و(50) عينة من اصابات الجروح والحروق، ومن خلال نتائج الزرع البكتريولوجي على اوساط اكار الماكونكي واكار الدم ووسط Eosin Methylen Blue , والتشخيص المظهري والكيموحيوي، وتاكيد التشخيص باستخدام نظام API20E ، تم الحصول على( 40 ) عزلة تعود لبكتريا Klebsiella. توزعت الى 20 عزلة تعود للنوع K.pneumoniae و(11) عزلة للنوع K.oxytoca و(9) عزلات تعود للنوع K.planticola . تم الكشف عن مدى قابلية العزلات على انتاج البكتريوسين بثلاث طرائق تضمنت : طريقة الحفر (wells)، وطريقة اقراص الاكار cup assay))، وطريقة التخطيط المتقاطع ( (cross - streaking assay. وتم الحصول على سبع عزلات منتجة للبكتريوسين . تم استخلاص البكتريوسين بنوعيه المرتبط بالجدار وغير المرتبط بالجدار , واظهر البكتريوسين الخام المرتبط بالجدار فعالية عالية مقارنة بالبكتريوسين غير المرتبط بالجدار , وكانت فعالية البكتريوسين المرتبط بالجدار (5120) وحدة/مل، وكان تركيز البروتين (4000) مكغم/مل وقطر منطقة التثبيط (20) ملم , بينما كانت الفعالية للبكتريوسين غير المرتبط (320) وحدة/مل وتركيز البروتين (500 )مكغم/مل وقطر منطقة التثبيط (15) ملم . اظهر البكتريوسين الخام المرتبط بالجدار تاثيرا على مجموعة من البكتريا المرضية تضمنت Enterobacter sakazaki ، Shigella flexneri، E. coli، Acinetobacter baumannii ، Enterobacter aerugenes ، K.planticola Proteus mirabilis ، Serratia marcescens، Enterococcus fecalis ، Staphylococcus aureus . ولم يظهر البكتريوسين فعالية على Enterococcus faecalis ، Serratia marcescens ، Proteus mirabilis ، Pseudomonas aeruginosa تم اجراء فحص الحساسية لمضادات الحيوية للعزلات البكتيرية المنتجة للبكتريوسين، فقد تم استخدام (13) مضادا حيويا شملت كل من ( Cefotaxim وGentamycin وNorfloxacinو Nitrofurantoinو Amikacinو Ampicillin وTrimethoprimو Pipracillinو AztreonamوImipenem وCiprofloxacin وAugmentin وCephalexin ) وتم اختيار العزلات الاكثر مقاومة لهذه المضادات لاكمال الجانب الوراثي . تمت دراسة المحتوى البلازميدي للعزلات الاربعة (K2, K4, K20,K38) التي كانت اكثر مقاومة لمضادات الحيوية , وبينت النتائج احتواء العزلة(K4 )على حزمتين بلازميديتين، اما العزلات الاخرى فقد احتوت على حزمة بلازمية واحدة , ثم اجريت عملية تحييد الدنا البلازميدي باستخدام مادتي SDS ومادة Acridin orange , لم تنجح مادة SDS في تحييد الحزم البلازميدية , بينما نجحت مادة Acridin orange في تحييد الحزم البلازميدية عند تركيز (512) مايكروغرام/مل .تم التحري عن قابلية العزلات المحيدة على انتاج البكتريوسين والمقاومة لبعض مضادات الحيوية المستخدمة في الدراسة واظهرت النتائج فقدان العزلات (K2, K4, K38) لصفة انتاج البكتريوسين، واحتفاظ العزلة ((K20 بصفة انتاج البكتريوسين. بالنسبة لمضادات الحيوية , احتفظت العزلات بمقاومتها لمضادات Ciprofloxacin وNorfloxacin وTrimethoprim , اما بقية المضادات والتي شملت كل من Pipracillin وAztreonamو Ampicillin وCefotaximو Gentamycinو Nitrofurantionو Amikacinو Cephlexin وAugmentin، فقد اصبحت العزلات حساسه لها.اجري فحص الاقتران البكتيري بين العزلات (K2, K4, K20,K38) والعزلة القياسية E.coliMM294, وقد نجحت العزلتان ( K2, K4) في تحقيق عملية الاقتران بينما فشلت العزلتان (K20,K38) في تحقيق عملية الاقتران , وقد اكتسبت العزلة القياسية صفة انتاج البكتريوسين والمقاومة لمضادات الحيوية قيد الدراسة . | The study included (200) clinical sample, (50) urine,(50) sputum , (50) sample of otitis media and (50) sample with injuries and burns. Morphological and biochemical tests were employed to diagnose bacterial species and the results showed they were (40) isolates.They were (20) K.pneumoniae ,(11) isolates of K.oxytoca and(9) isolates of K.planticola. The ability of isolates to produce bacterocin were detected by three methods included the methods of wells, cup assay method, and cross - streaking assay. Results revealed that(7) isolates were able to produce bacteriocin.The wall - degraded bacteriocin was (5120) unit\ml, and protein concentration was (4000) μg/ml and the diameter of inhibition area was 20mm, while non wall - degraded was (320)unit\ml and the protein concentration (500) µ\ml and the inhibition area (15) mm. The effect of crude bacteriocin on some clinical isolates including Enterobacter sakazakii,S.auereus, K.oxytoca , Shigella flexneri, E. coli, Acinetobacter baumannii, K. planticola and Enterobacter aerogenes was studied. The results showed thier was effect on the above isolates, while the isolates of Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterococcus fecales and Ps.aeruginosa were resistant to bacteriocin. Sensitivity of isolates that produced the bacteriocin was tested against (13) antimicrobial agents included (Cefotaxime, Gentamycin, Norfloxacin, Nitrofurantoin, Amikacin, Ampicillin, Trimethoprim, Pipracillin, Aztreonam, Ciprofloxacin, Imipenem ,Augmentin and Cephalexin). Results revealed that four isolates were resistant to the antibiotics. The plasmid content of the four isolates (K38, K20, K4, K2) which were the most resistant to the abovementioned antibiotics was studied ,The results showed That these isolates contain plasmids of different molecular weight. Curing was conducted by the use of SDS and Acridin orange. The isolates lost the plasmids at concentration 512µg/ml of Acridin orange. The production of bacteriocin and the resistance of the four selected isolates to the antibiotics were studied. The results showed that three of the examined isolates were unable to produce bacteriocin, they were (K38, K4, K2).The fourth isolate(K20) was able to produce bacteriocin.The four isolates appeared to resist the antibiotics Trimethoprim, Ciprofloxacin and Norfloxacin, while they were sensitive to the other antibiotics. The bacterial conjugation between (K38, K20, K4, K2) isolates and the standard strain E.coli MM294 was studied. The results showed That (2) isolates (K4, K2) were successful in transferring plasmids , while the other two (K20, K38) failed. The transconjugants were able to produce bacteriocin and resist Antibiotics.

تقدير مستوى انترلوكين - 1 - بيتا وانترلوكين - 6 في مصول وادرار اطفال مصابين بالتهاب الحويض والكليه الحاد == Estimation of IL - 1? and IL - 6 in Sera and Urine of Acute Pyelonephritis Patients

Author name: علاء لعيبي عبد الله الصرخي

Supervisor name: انتصار ناظـم خلخال

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: يعد التهاب الحويض والكلية الحاد من الامراض المعدية الشائعة في الاطفال وقد يؤدي الى تلف الكلى الدائم.صممت هذه الدراسة لغرض قياس مستويات اثنين من الانترلوكينات المهمة خلال الاصابة البكتيرية هما IL - 6 او IL - 1β، لدى الاطفال المصابين بالتهاب الحويض والكلية الحاد ولتحقيق هذا الهدف فقد جمعت (95) عينه ادرار ودم من اطفال باعمار تتراوح من (2شهر - 12عام) يعانون من حمى,حرقة عند التبول, وكثرة التبول (زيادة عدد مرات التبول) في مستشفى ابن البلدي للاطفال ومستشفى حميات للاطفال (بغداد) لمدة خمسة اشهر فضلا عن (20) عينه ادرار ودم لاطفال اصحاء من نفس الفئة العمرية عدت كمجموعة سيطرة. شخص 26 من الاطفال المصابين بالتهاب الحويض والكلية الحاد بواسطة الاعراض السريرية المميزة (حمى,غثيان,قيء, الم في الخاصرة , مع عسر وكثرة التبول) من قبل الاخصائي بالامراض البولية كما تم تاكيد التشخيص بالفحوصات المختبرية المتوفرة فضلا عن اجهزة الكشف بالموجات فوق الصوتية. كانت نتائج النسب المئوية للمظاهر السريرية للمصابين (الحمى,كثرة التبول,الم خاصرة، عسر التبول,والغثيان او القيء (88,4%, 83,3%, 61,5 %, 53,8%, 34,6%) على التوالي.اما نسب الحالات الاخرى (المعقدة) فكانت : 34,4% مع ارتداد مثاني, 23% مع hydronephros،19,2%يعانون من فشل كلوي حاد, 7,6% حصى الكلية 3,6% مع ارتفاع ضغط الدم.اظهرت النتائج ان النسبة المئوية للاطفال المصابين من الذكور (65,38%) اعلى من الاناث (34,62) كما ظهرت فروقات معنوية واضحة بين المصابين من الفئات العمرية المختلفة مقارنة مع بعضها وكذلك مع السيطرة,كذلك ظهرت فروقات معنوية مهمة في اعداد الخلايا القيحية والبكتريا البولية فضلا عن تراكيز البروتين البولي عند مقارنتها بين الفئات العمريه ولدى الجنسين كذلك مع السيطرة.شخصت العوامل المسببة للاصابة باستخدام نظام(Vitek2) وتم تاكيد التشخيص عند زرع الادرار على وسط اكار عالي الدقة والخصوصية باصابات المسالك البولية (HiCrome) تعتمد نتيجة التشخيص على التفاعل اللوني بين انزيمات العزلات البكتيرية المختلفة ومكونات الوسط الزرعي المتخصص هذا. واظهرت النتائج ان النسب المئوية للعزلات البكتيرية كانت كالاتي : (50%, 15,38% ,7,6%, 23,09%) لبكترياEnter.fecalis ,S.aureus ,E.coli, اصابة مختلطة باكثر من جنس بكتيري , فضلا عن الخميرة Candida albecans (3,85%)، كما ازدادت اعداد خلايا الدم البيض لاسيما الخلايا العدلة وعلى مستوى (p<0.05) , وبمستوى (p<0.01) عن بروتين CRPلدى الاطفال المصابين مقارنة مع مجموعة السيطرة، بينما لم تظهر اي فروقات معنوية في مستويات اليوريا والكرياتنين في الدم بين المرضى والسيطرة.قيسـت تراكـيز IL - 1β في الادرار والمصل للاطفال المصابين وكانت معدلاتها (1060,09, 571,84) جزء من الغرام/ مل على التوالي واظهرت فروقا معنوية مهمة عند مقارنتها مع معدلاتها في ادرار ومصول اطفال السيطرة ( 34,5, 45,29) جزء من الغرام/ مل عند مستوى معنوية (p < 0.05).لوحظت فروقات معنوية واضحة عند مقارنة معدلات IL - 6 في الادرار والمصل والتي بلغت ( 109,42, 28,86) جزء من الغرام/ مل مع معدلاتها لدى السيطرة (12,59, 6,93) جزء من الغرام/ مل عند مستوى معنوية ((p< 0.05. | Acute pyelonephritis (APN) is a common infectious disease in children may result in permanent renal damage. This study has been designed for measuring the level of IL - 1β and IL - 6 in pediatric APN during bacterial infection .A total of (95) urine &blood sample have been collected from children 2month - 12 years suffering from fever, dysurea, frequency from Dec.2013 - Apr.2014 at Ibn Al - Blady hospital and Welfare Teaching Hospital/ Medical city in Baghdad. Twenty Sample from healthy individuals of the same age range as control group. Twenty - sex patients of APN were included in the present study, those patients have been diagnosed by urologist, the diagnosis have been confirmed by available investigation methods; laboratory tests and ultrasound. Results of clinical features (fever, frequency, loin pain, dysuria and nausea or vomiting) were 88.4%, 83.3%, 61.5%, 53.8%, 34.6% respectively, Others were presented as complicated cases 34.6% with vesicoureteral reflux, 23.0% with hydronephros, 19.2% with acute renal failure, 7.6% with stone and 2.6% with hypertension. The percentage of infected males 65.38% was higher than females 34.62% and clear significant differences (p < 0.01) were noted between patients of different ages groups .Also important differences (p < 0.01) have been appeared in pyuria nembers and bacteruria as well as in proteinuria concentrations when compared between patients of two genders in different age groups to control group. Vitek 2 system has been used for suspected the identification of APN causative agents , diagnosis that was supported by culturing urine samples on high specialized and accurate medium; HiCrome medium which is specific for UTIs, Identification result depend on coloured reaction between microorganism enzymes and some reagents in that culture medium.Results were as following : 50.0% of E. coli , 15.38% of Staphylococcus. aureus , 7.6% of Enterococcus.faecalis ,and 23.09% of mixed infection (more than one bacterial genus), finally the yeast Candida albicans is 3.85%.No significant differences in urea and creatinine levels in patients sera compared to control while white blood cells specially neutrophiles (p < 0.05) as well as C - Reactive protein (p < 0.01) were significantly higher in patients than control. Level of IL - 1β has been measured in urine and serum of patients, the means 1060.09, 571.84 pg/ml respectively , have been clarified important significant differences p < 0.05 in comparison with their levels in controls 34.05, 45.29 pg/ml . Apparent significant differences p < 0.05 have been showed between IL - 6 concentration in urine and serum of patients ,means were; 109.24, 28.86 pg/ml comparing to control 12.59, 6.93 pg/ml .

دراسة جزيئية لعوامل الالتصاق في بكتريا Escherichia coli الممرضة للمسالك البولية وعلاقتها بمقاومة Fluoroquinolones == Molecular Study of Adherence Factors in Uropathogenic Escherichia coli Related to Fluoroquinolones Resistance

Author name: شيماء خضر عباس العلاق

Supervisor name: سوسن حسن عثمان كورجي

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: جمعت 150عينة ادرار من مرضى خمج المسالك البولية ومن مختلف الاعمار للفترة من تموزالى تشرين الثاني 2011 .اعتمد التشخيص البكتيري على المواصفات الزرعية والمجهرية والفحوصات الكيموحيوية , والتشخيص النهائي والدقيق للعزلات في وقت مبكر للكشف عن الانواع بواسطة استخدام فحص Api20E .تم التشخيص الجزيئي لجينات عوامل الالتصاق وجين مقاومة الفلوروكوينولونات باستخلاص الدنا البكتيري بطريقة الغليان ومن ثم اخضع الى اختبار البلمرة التضاعفي التسلسلي (PCR) . تم اجراء اختبار الحساسية للمضادات الحيوية , فضلا عن تقدير التركيز المثبط الادنى (MIC) لاربع مضادات من الفلوروكوينولونات . اظهرت النتائج ان توزيع اصابات اخماج المسالك البولية في الاناث (99(66%) بينما بلغت في الذكور 51(34%)) وسجلت اعلى نسبة من الاصابة في النساء البالغات المتزوجات 67(44.7%) .اظهرت النتائج ان بكتريا E.coli كانت الاكثر شيوعا في مرضى خمج المسالك البولية 65 عزلة (43.3%). بينت جميع العزلات قدرتها على الالتصاق على الخلايا الطلائية للقناة البولية للانسان (100%) , اذ اظهرت نسب مختلفة من الالتصاق تراوحت بين 8 الى 63 خلية بكتيرية / خلية طلائية .اظهرت عزلات E.coli احتوائها على ثلاثة انواع من عوامل الالتصاق (CAF) وبنسب مختلفة . النوع الاول (CAFl) ووجد في 58 عزلة (89%) , النوع الثاني (CAFΠ) ووجد في 35 عزلة (54%) والثالث (CAFШ) وجد في 36 عزلة (55%) . عند اختبار حساسية العزلات تجاه 12 مضاد جرثومي , اظهرت عزلات E.coli مقاومة تامة (100%) لمضاد Augmentin(Amoxicillin/Clavulanic acid) (99%) بينما كانت اقل مقاومة للمضادات Pefloxacin , Norfloxacin, Nitrofurantoin وبنسبة(34, 35, 22)% على التوالي .اظهرت النتائج ان اعلى نسبة من المقاومة المضاعفة المشتركة (42%) كانت في العزلات التي قاومت خمسة الى ثمانية مضادات . فيما حددت التراكيز المثبطة الدنيا لاربعة مضادات من الفلوروكوينولونات ,فاظهرت النتائج ان هناك اختلافا واضحا في قيمتها . تم اختيار 28 عزلة E.coli من عزلاتنا المحلية بالاعتماد على درجة مقاومتها العالية للمضادات ,اظهر كشف البلمرة التضاعفي التسلسلي (PCR) المفرد (Uniplex PCR) والمشترك (Multiplex PCR) عن وجود جينات الالتصاق الضارية والمتضمنة P (papC), type 1 fambria fimH ,adhesion S (sfaD/E) and afimbrial adhesin (afaB/CШ) حيث تم الكشف عن(22 isolates (79%),20(71%), 6(21%),4(14%)) على التوالي . تم الكشف عن جين مقاومة الكوينولونات gyrA في كل العزلات 28 (100%). في هذه الدراسة تم اعتماد gyrAبديلا عن استخدام 16s rRNA في تشخيص السلالات البكتيرية.اذ اعطت جميع العزلات حزم عند الحجم الجزيئي (518 bp) دلالة على وجود الجين باستخدام تقنية (PCR) .واخيرا .اظهرت النتائج ان عزلات E.coli الممرضة للقناة البولية (UPEC) والمقاومة للكوينولونات تبدي انخفاضا في عوامل ضراوتها عن العزلات الحساسة للكوينولونات ,اظهرت نتائجنا اعلى نسبة لعوامل الضراوة في العزلات التي قاومت ثمانية مضادات اعطت نسبة 18% منها تمتلك عامل الالتصاق الاول (CAFl) , 14%تمتلك (CAFΠ) و12% من هذه العزلات تمتلك (CAFШ) وذلك يشير الى ارتباط مباشر لمقاومة الكوينولونات مع انخفاض وجود جينات الضراوة (تراجع جيني).و اظهرت النتائج ايضا انه جينات الضراوة اقل انتشارا (PapC (86.3%), fimH (68.1%), afaBCIII (13.6%), sfaDE (9%)) في العزلات التي قاومت كل مضادات الفلوروكوينولونات .هذه العلاقة ربما تتاثر بواسطة التراجع الجيني . | One hundred fifty urine samples were collected from urinary tract infection patients from different ages during the period of July 2011 to November 2011. The bacterial diagnosis on cultural and microscopical characteristics of bacterial cell and biochemical tests. The final and accurate diagnoses of the isolates as the early mentioned species were done using the API 20E system. Molecular identification for adhesion factors and fluoroquinolone resistant gene was done by DNA extraction by boiling method, then subjected to conventional PCR .The antibiotic sensitivity test was done, also the minimum inhibitory concentration (MIC) for four Fluoroquinolone antimicrobial agents was studied. The results showed that the distribution of UTI in female were 99(66%), while in male were 51 (34%). However, the high percentages of UTI were observed within the adult married women 67(44.7%). The results showed that E.coli was the most common microorganisms in UTI patients, 65 isolates (43.3%). All the isolates showeded ability of adherence to uroepithelial cells of human's urinary tract (100%) of the isolates presented adherence that mean number of bacteria adhered to uroepithelial cells ranged from 8 to 63. E.coli isolates exhibited the presence of three types of colony adhesion factors (CAF) at different rate. Type one (CAFl) observed in 58 isolates (89%), while type two (CAFΠ) in 35 isolates (54%), and (CAFШ) in 36 isolates (55%). Sensitivity of E.coli local isolates toward 12 antimicrobial agents showed complete resistance (100%) to Augmentin (Amoxicillin/Clavulanic acid), while they were less resistance to Pefloxacin, Norfloxacin, Nitrofurantoin at (34, 35, 22)% respectively. The results showed that the highest rate of multidrug resistance (42%) was observed in isolates were able to resist 5 to 8 antimicrobial agents. The minimum inhibitory concentrations for four Fluoroquinolone antimicrobial agents showed an obvious different between their values.The local isolates of E. coli selection 28 isolates depending upon high degree of multi antibiotic resistance. The PCR assay (Uniplex PCR and Multiplex PCR) showed prevalence of virulent adhesion genes P (papC), type 1 fambria fim H, adhesion S (sfaD/E) and afimbrial adhesin (afaB/CШ), were detected (22 isolates (79%), 20(71%), 6(21%), 4(14%)) respectively. The quinolone resistance gene gyrA detected in all isolates 28 (100%). In the present study depended upon gyrA gene (housekeeping gene) as alternative to 16s rRNA for the identification bacterial strains. All the isolates give bands at the molecular size (518 bp) an indication of a gene by using PCR technique. Finally ,the results have shown that Fluoroquinolone resistant uropathogenic E.coli (UPEC) isolates express fewer virulence factors than Fluoroquinolone susceptible isolates .The persent results showed the highest rates of virulence factors in isolates that resisted eight antibiotics which was obtained to 18% of these isolates have(CAF l ), 14% have(CAFΠ ) and 12% of the isolates have (CAFШ). This finding suggests that fluoroquinolone could be directly associated with decreased prevalence of virulent genes (genetic back) .Also the results showed that all 4 virulent genes under the study were lower prevalent (PapC (86.3%), fimH (68.1%), afaBCIII (13.6%), sfaDE (9%)) in the isolates resistance for all fluoroquinolone and quinolone antimicrobial agents. that the relationship may be influenced by the genetic background.

التنميط والتحليل الجزيئي للمكورات العنقودية الذهبية المعزولة من نماذج سريرية == Molecular Analysis and Typing of Staphylococcus aureus isolated from clinical samples

Author name: سوسن محمد كريم

Supervisor name: سوسن ساجد محمد علي الجبوري | منعم رضوان علي

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Doctorate

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: • جمعت خلال الدراسة اربعة وثمانون عزلة من بكتريا المكورات العنقودية من عدد من مستشفيات بغداد للفترة الواقعة ما بين تموز - تشرين الثاني عام (2013) موزعة ما بين (43) عزلة من الالتهابات الجلدية , (15) عزلة من التهاب المسالك البولية , (5) عزلات لكل من الدم والتهابات الاذن , (3)عزلات من التهابات الانف ،(2)عزلتين من التهاب العيون وعزلة واحدة من لكل من القشع والسائل المنوي و(9) عزلات اخذت من مواقع بيئية مختلفة للمستشفيات .• تم العزل الاولي لبكتريا المكورات العنقودية الاوساط الزرعية واعتمادا على الصفات المظهرية على الاوساط الزرعية والفحوصات الكيموحيوية فضلا عن التشخيص بنظام (API Staph system) لتكون المحصلة النهائية (74) عزلة تعود لبكتريا المكورات العنقودية الذهبية .• تم التحري عن المكورات العنقودية المقاومه للمثيسلين بعدة طرق منها الطرق المظهرية وباستخدام طريقة الانتشار بالاكار حيث اظهرت النتائج ان هنالك 55 (74.32%)عزلة من المكورات العنقودية الذهبية مقاومة للمثيسلين في حين بلغ عدد العزلات الحساسة 8(10.82%) وقد لوحظ وجود عدد من العزلات التي ابدت مقاومة متوسطة للمثيسيلين 11 (14.86%) كما واستخدمت طريقتين مختلفتين من الطرق الوراثية للتحري عن مقاومه البكتريا للمثيسيلين . وذلك عن طريق التحري عن المورثات المحفوظة تطوريا (femA) المورث المسؤول عن تاكيد تشخيص النوع اضافة الى التحري عن المورث (mecA) المسؤول عن صفة مقاومة البكتريا للمثسيلين وباستخدام تقنية التفاعل التسلسلي المتضاعف (Polymerase Chain Reaction). قد اعتمدت طريقتان لتحضير دنا القالب، طريقة الغليان وقد اظهرت احتواء74 (100%)عزلة من المكورات العنقودية الذهبية في حين احتوت61 / 74عزلة على المورث (mecA) وبالاعتماد على وجود مورث صفة المقاومة للمثيسلين قد بلغت نسبة المكورات العنقودية الذهبية المقاومه للمثسيلين (82.43%) ، كما وبلغ عدد عزلات المكورات العنقودية الحساسة للمثيسلين التي لم تحتوي على مورث (mecA) 13/ 74 (17.57%) . ومن جهة اخرى استخدمت الطريقة المباشرة في تحضير دنا القالب واظهرت النتائج امتلاك فقط 17(22.97%) عزلة على مورث (femA) كما اظهرت 57/74 (77.03%)عدم امتلاكها على المورث، في حين ابدت (7) من العزلات التي ابدت اجابيتها لمورث (femA) امتلاكها على مورث (mecA) ولذلك فان نسبة بكتريا المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسلين بلغت (41.17%) في حين المكورات الحساسة للمثيسلين قد بلغت (58.83%). وقد اثبتت طريقة تحضير دنا القالب بالغليان بانها كانت اكثر كفاءة ودقة في الكشف عن المورثات من الطرق الاخرى .• تم استخدام طريقة الانتشارالثنائي في الاكار للكشف عن صفة المظهرية لمقاومة البكتريا تجاه مجموعة الماكروليدات، اللنكوز امايد والستربتوكرامين B وقد اظهرت النتائج (18/74) عزلة تمتلك صفة مقاومة دائمية للارثرومايسين (24.32%) توزعت بين (13/61) عزلة من عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومه للمثيسلين (21.13%) و(5/13) عزلة من عزلات المكورات العنقودية الذهبية الحساسة للمثيسلين (38.46%) ، كما واظهرت النتائج وجود (4/74) عزلة تمتلك صفة المقاومة المستحثة للاريثرومايسين(6.55%) وكانت كل العزلات مقاومة للمثيسلين واخيرا (29/74) عزلة من العزلات المقاومة والحساسة للمثيسلين ابدت مقاومة متوسطة للاريثرومايسين .• اظهرت النتائج سيادة صفة المقاومة الدائمية للاريثرومايسن بين عزلات المكورات العنقودية الذهبية الحساسة للمثيسلين بالمقارنة مع العزلات المقاومة للمثيسيلين وكذلك لوحظ وجود صفة المقاومة المستحثة للاريثرومايسن بين عزلات البكتريا السريرية المعزولة من الادرار والدم والافرازات العامة.• استخدمت تقنية PCR للكشف عن وجود مورثات مقاومة الاريثرومايسين (erm A, erm B and erm C) وقد اظهرت النتائج تغلب مورث erm A (7.35%) ووجوده في (5/68) عزلة من عزلات المكورات العنقودية الذهبية والتي تمتلك مختلف اشكال الصفات المظهرية لمقاومة المثيسلين وجميع العزلات كانت مقاومة للمثيسلين. في حين تواجد مورث erm C في (4/68) ونسبة (5.88%) اثنان منها كانت عزلة من الدم والقشع وقد كانتا موجبة في فحص التحري عن مقاومة الاريثرومايسين ، كما واظهرت نتائج فحص PCR عدم امتلاك العزلات على مورث erm B . ايضا كشفت النتائج عن سيادة المورثات erm A وerm C في التشفير لصفة المقاومة المستحثة للاريثرومايسين وانه لا دور يذكر لمورث erm B في مقاومة الاريثرومايسين.• تم التحري بتقنية PCR عن انتشار ووبائية مورث pvl بين عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسيلين وقد اظهرت النتائج وجوده في(4/61) ونسبة (6.55%) .• تم استخدام طريقة الانتشار بالاكار للتحري عن حساسية البكتريا اتجاه المضادات الحيوية وقد اظهرت النتائج مقاومة العزلات بشكل كامل (100%) لكل من الكلوكساسيلين والاوكساسيلين والسيفيبيم ،ومقاومة عالية اتجاه كل من امبسلين/ كلافيلونك اسد (98.36%) والسيفتازديم (95.2%) . وكانت هنالك مقاومة متوسطة اتجاه التتراسايكلين (31.14%) ومقاومة قليلة اتجاه كل من الازيثرومايسين (24.6%) والفانكومايسين (16.4%) والجنتامايسين (13.11%) والسبروفلوكساسين (13.11%) واقل مقاومة اتجاة الامبنم (6.55%). • استخدمت طريقة UPGMA المتوسط الحسابي Unweighted Pair - Group Method using arithmetic Average لبناء شجرة تطور السللالات Phylogenetic treeوتحديد العلاقة التطورية dendroram واعتمد model Tamura - Nei لقياس المسافة الوراثية بين انواع المكورات العنقودية للتعبير عن مدى تطور تلك المورثات. اظهرت النتائج للتحليل الشجيري وجود 151 عقدة و76 عقدة طرفية . مما يعكس وجود تنوع عالي في نمط المقاومه لفحص الحساسية للمضادات الحيوية بين العزلات المدروسة, وكذلك تنوع واضح وعالي بين عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة والحساسة للمثيسلين .مما يعكس الطبيعه التطورية لتلك العزلات. • تم اخضاع كل عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسلين والحساسة للكشف عن مورث spa بواسطة استعمال بواديء متخصصة لتضخيم المنطقة المتغايرة من المورث وبحجم القطعة المكثره (300bp) وقد اظهرت النتائج (47/74) موجبة لمورث spa حيث كانت المكورات المقاومة للمثيسلين (67.2%) في حين كانت المكورات الحساسة للمثيسلين (46.15%) .• تم اختيار (25) نموذج من نواتج PCR لمورث spa تعود لعزلات ذات مصادر عزل مختلفة وتم ارسالها لغرض تحديد تتابع القواعد النايتروجينية، تم تسجيل كل البيانات التي تم الحصول عليها من تحديد تتابع القواعد النايتروجينه في بنك المورثات العالمي (المركز الوطني لمعلومات التكنلوجيا الحيوية National center for Biotechnology Information ) وكذلك في بنك اليابان ( DNA Data Bank of Japan) وبنك المورثات الاوربي التي تبدا بالتسلسل LC038119 وتنتهي بالتسلسل LC038142 .• اظهرت النتائج ان القطع المكثرة للمناطق المتغايرة كانت مختلفة في الاحجام وتراوحت اطوالها (65 - 335bp) من اصل الجين كذلك اجري تطابق تتابع القواعد النايتروجينة وترجمة البروتين وتحديد العلاقة التطورية وشجيرات تطور السلالات باستعمال (UPGMA) وبرنامج geneious software وقد اظهرت النتائج وجود نوعين من الشجيرات واحدة للتتابعات القصيرة (65 - 190bp) وواحدة للتتابعات الطويلة (190 - 335bp) • تم هظم المورث spa بواسطة انزيمين من الانزيمات القاطعة HinfI وHindIII واظهرت النتائج تنوعا ملحوظا في الطراز الوراثي بين العزلات . | • Eighty four isolates of Staphylococcus spp. were collected from different hospitals in Baghdad province, during the period July 2013 to November 2013, distributed as : 43 isolates from skin infection ; 15 isolates from UTI; 5 isolates from each blood and ear infection; 3 from nasal swab ; two isolate from eye infection ; while one isolate obtained from each sputum and seminal fluid and 9 isolates were taken from various hospitals environments and sites.• For preliminary isolation of Staphylococcus spp. was used culture media, and depending on features on cultures, Biochemical tests and (API Staph system).The final results were (74) isolates belonged to Staphylococcus aureus.• different methods for screening to methicillin resistance S. aureus, it were used phenotypic method (disc diffusion method), the results showed 55(74.32%) MRSA isolates, 8(10.82%) MSSA and 11(14.86%) intermediate resistance to cefoxitin. While in genotypic methods were used PCR technique to detection housekeeping gene (femA) responsible to confirm species and mobile genetic element (mecA) to confirm resistance of isolates to methicillin, PCR technique was done by used two different methods to prepare template DNA.• the results of PCR technique with used template DNA prepared by boiling method have been revealed all S. aureus isolates 74(100%) contained femA gene (100%) while 61/74(82.43%) isolates contained mecA gene (MRSA) and 13/74(17.57%) isolates devoid mecA gene MSSA. On the other hands, The results of PCR technique with used template DNA prepared by direct colony have been revealed only 17(22.97%) isolates contained femA gene and 57(77.03%) isolates was devoid femA gene (77.03%), the positive isolates to femA gene have been revealed contained 7(41.17%) mecA gene while 10(58.83%) isolates devoid mecA gene. So used PCR techniques with template DNA prepared by boiling method was appeared the effective method for screening about MRSA and detection mecA gene reflected on standard methods to confirm S. aureus to be MRSA.• Double diffusion disc was used method to screening about MLSB phenotype and the results showed 18/74(24.32%) S. aureus isolates had constitutive resistance to erythromycin cMLSB phenotype (which is distributed to13/61(21.31%) MRSA and 3/13(38.46%)MSSA, 6/74(9.83%) S. aureus isolates sensitive to erythromycin, all of them was MRSA, 4/74(6.55%) S. aureus isolates had inducible resistance to erythromycin D - shape also all of them was MRSA, 9/74(14.75) S. aureus isolates showed MS phenotype was resistance to erythromycin and sensitive to clindamycin without D - shape and finally 29/74) S. aureus isolates showed intermediate resistance to erythromycin distributed between MRSA and MSSA.• Results showed a higher prevalence of the cMLSB phenotype in the MSSA isolates compared with MRSA isolates, also was observed iMLSB phenotype among clinical samples of S. aureus specially MRSA isolates more frequently in urine, blood and general secretions.• PCR technique was used for screening about ermA, ermB and ermC genes and the results were showed the percentage of ermA gene in S. aureus isolates 5/65(7.35%) with different phenotypic resistance forms to erythromycin all five isolates is MRSA while ermC gene percentage was 4/68(5.88%) S. aureus isolates, two of them showed cMLSB phenotype and harboring with ermA gene and others two isolates recovered from blood and sputum showed inducible MLSB with D - shape phenomenon, none of the S.aureus isolates harboring with ermB gene. The results were also revealed that ermA and ermC predominant erm genes found in S. aureus and the ermC gene the prevalence gene in inducible Macrolides resistant MRSA and no role was found to ermB gene in Macrolides resistant MRSA.• PCR technique was used for screening about prevalence of pvl gene among S. aureus isolates and the results showed 4/61(6.55%) harboring with pvl gene.• Disc diffusion method was used to screening about antibiotics sensitivity and the results showed completely resistance (100%) toward cloxacillin, oxacillin and cefepime while some isolates showed high resistance toward Amoxicillin /Clavulinic acid (98.36%) and Ceftazidime (95.2%). the moderate resistance toward tetracycline (31.14%), the low resistance toward azithromycin (24.6%), vancomycin (16.4%), gentamycin (13.11%), ciprofloxacin (13.11%) and the lowest resistance appeared toward imipenem (6.55%).• unweighted pair group method (UPGMA) was used to build phylogenetic tree and to find dendrogram analysis , Adoption of the Model Tamura - Nei, to measure the genetic distance between the types of Staphylococcus aureus to express the evolution of these genes, the results were showed dendogram and phylogenetic tree have (151) node and (76) tips. also reflected highly diversity resistance antibiogram among isolates and high diversity between MRSA and MSSA isolates still found some similarities in antibiogram pattern. Reflecting the evolutionary nature of these isolates.• all MRSA and MSSA isolates were subjected to screening about spa gene by used specific primers for variable region with PCR product size (300bp), and the results showed (47/74) isolates with positive results and (27/74) with negative results, (67.2%)MRSA isolates showed positive results while(46.15%)MSSA isolates showed positive to spa gene.• the 25 samples of PCR products from spa gene related to different sources of isolation were send for sequencing, then all data obtained from genes sequencing were submitted to gene bank national center for biotechnology information (NCBI), DNA data bank of Japan (DDBJ) and European Bioinformatics Institute (EMBI) under accession number started with (LC038119) and ended with (LC038142). ,The results showed the size of amplified fragments were variable and ranged from (65 - 335bp) in the original gene also pairwise sequence alignment to spa gene fragment, protein translation, Dendogram and phylogenetic tree were built by using (UPGMA) and genetic distance model Tamura - Nei with cost matrix identity (1.0 - 0.0) with geneious software, the results were showed two dendogram and phylogenetic tree first for short sequence (65 - 190bp) have 17 node and 9 tips while second for long sequence (190 - 335bp) have 31 node and 16 tips.• PCR - RFLP for spa gene was done by using two restriction enzyme HindIII and HinfI and the results showed high diversity among MRSA isolates

نزعات مقاومة مكروليد في العقدية المقيحة والرئوية المعزولة من الاطفال العراقيين المصابين بامراض الحلق المعدية == Macrolide Resistance Trends in Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae Isolated from Iraqi children with throat infections

Author name: سعاد عبد الجبار عبد الزهرة الساعدي

Supervisor name: محمد فخري احمد | مروان صالح محمد النمر

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: اجريت هذه الدراسة على مرضى مراجعي العيادة الاستشارية في مستشفى ابن البلدي في مدينة بغداد (العراق) للفترة من تشرين الثاني 2007 الى شباط 2008 . تم تعين المرضى بشكل عشوائي اذ تم اختيار 108 حالة (60 انثى و48 ذكر) تراوحت اعمارهم بين 18 شهر الى 12 سنة والذين يعانون من التهاب الحنجرة والبلعوم .تم جمع مسحات البلعوم من كل مريض بهدف عزل وتشخيص البكتريا . اعتمد كل من فحص D - test وOptochin كفحص اساسي لتميز بكتريا Streptococcus pyogenes المقاومة للمضادات الميكروليدية . اظهرت النتائج ان 94 حالة ظهرت عليهم العلامات السريرية واعراض التهاب اللوزتين والبلعوم ، 7 حالات ظهرت عليهم اعراض الحمى القرمزية (Scarlet fever)، و14 مريض اعتبروا حاملين للمرض .تم تشخيص بكتريا S. pyogenes في 65 عزلة من اصل 73 وكانت 16 منها مقاومة لمضادات الحياة الميكروليدية ، وتم تشخيص 8 عزلات من Streptococcus pneumoniae .توزعت المجاميع المقاومة للمضادات الحياة الميكروليدية الى : مجموعة بكتريا مقاومة من نوع iMLSB بواقع 3 عزلات ، ومن نوع cMLSB بواقع 8 عزلات ومن نوع M - phenotype بواقع 5 عزلات ، واظهرت عزلتين من نوع معكوس D - Shape (Inverted D - Shape) .كانت التراكيز المثبطة الدنيا باستخدام تقنية التخفبف الدقيق Micro - dilution لـ17 مضاد حيوي متفاوتة بالنسبة الى العزلات (حساسة او مقاومة للمضادات الميكروليدية واشكالها المظهرية) . اظهرت بكتريا S. pyogenes الحساسة للـerythromycin والـclindamycin تركيز مثبطا ادنى عند 0.25 مايكروغرام/مليليتر لكل من الـCo - amoxicillin + clavulanic acid وceftriaxone .بكتريا S. pyogenes التي قاومت كل من erythromycin وclindamycin كانت حساسة عند التركيز 0.25 مايكروغرام/مليليتر للـampicillin وamoxicillin وCo - amoxicillin - clavulanic acid وgentamicin وceftriaxone وciprofloxacin وgatifloxacin .كانت عزلات S. pyogenes من نوع M - phenotype حساسة للتركيز 0.25 مايكروغرام/مليليتر من azithromycin وlincomycin وampicillin وCo - ampicillin cloxacillin وCo - amoxicillin - clavulanic acid وgentamicin وcephalothin وcefotaxime . ادنى تركيز مثبط لعزلات S. pyogenes من نوع D - Shape موجب كان 0.25 مايكروغرام/مليليتر لمضادات ampicillin وamoxicillin وCo - amoxicillin - clavulanic acid وgentamicin . كانت عزلات S. pneumoniae حساسة لكل مضادات الحيوية التي تم دراستها وبتراكيز مثبطة ادنى تراوحت بين (1 - 0.25) مايكروغرام/مليليتر .تم تحديد 3 عزلات من S. pyogenes متحملة للبنسلين . يستنتج من ذلك ان عزلات الـS. pyogenes المقاومة لمضادات الميكروليدية كانت تحتل نسبة عالية ، واكثر الاشكال المظهرية شيوعا كان من نوع cMLSB .كل من العزلات المقاومة للـfluoroquinolone والمتحملة للبنسلين penicillin tolerant كانت متواجدة في العزلات المقاومة والحساسة لمضادات الميكروليدية .حساسية عزلات S. pyogenes لمضادات الحيوية كانت متفاوتة بالنسبة الى حساسيتها او مقاومتها لمضادات الحيوية الميكروليدية وكذلك بالنسبة الى التنويع المظهري للعزلات المقاومة . | This study was conducted on patients attending the consultant clinic at Ibn - Al - Balady Hospital in Baghdad, Iraq from November 2007 to February 2008. The patients were allocated randomly, after they examined thoroughly by pediatrician, to be admit in this study. A total number of 108 (60 girls and 48 boys), their ages ranged from 18 months to 12 years, with provisional diagnosis of tonsillo - pharyngitis were enrolled in this study. Throat swab was obtained from each patient for isolation and identification of microorganisms. Double - disk test (D - test) and optochin test, fundamental for discrimination macrolide resistant Streptococcus pyogenes were done. The results showed that 94 patients had clinical signs and symptoms of tonsillo - pharyngitis, 7 patients were diagnosed as scarlet fever and 14 patients were considered as carriers. S. pyogenes was identified in 65 out of 73 isolates; sixteen of them were macrolide - resistant strain, and (8 isolates) of Streptococcus pneumoniae were identified. The phenotypes of macrolide resistant S. pyogenes were distributed as iMLSB (3 isolates), cMLSB (8 isolates) and M phenotype (5 isolates). Two isolates showed inverted D - Shape patterns. The minimum inhibitory concentration (MIC), using microdilution technique, of seventeen antimicrobials were varied with respect to the isolates whether susceptible or resistant to macrolide in addition to their phenotypes. The lowest MIC for susceptible isolates to erythromycin and clindamycin, was 0.25 µg/mL of Co - amoxicillin + clavulanic acid and ceftriaxone. S. pyogenes which resisted to both erythromycin and clindamycin were susceptible to 0.25 µg/mL of ampicillin, amoxicillin, Co - amoxicillin - clavulanic acid, gentamicin, ceftriaxone, ceftazidime, ciprofloxacin and gatifloxacin. M - phenotype of S. pyogenes isolates were susceptible to 0.25 µg/mL of azithromycin, lincomycin, ampicillin, Co - ampicillin - cloxacillin, Co - amoxicillin - clavulanic acid, gentamicin, cephalothin and cefotaxime. The lowest MIC for S. pyogenes characterized by positive D - shape test was 0.25 µg/mL of ampicillin, amoxicillin, Co - amoxicillin - clavulanic acid and gentamicin . S. pneumoniae isolates were susceptible to all tested antimicrobials with MIC range of 0.25 - 1 µg/mL. Penicillin - tolerant S. pyogenes was detected in 3 isolates. It concludes that Macrolide resistant S. pyogenes was found in high percent, and the commonest phenotype was cMLSB. Both fluoroquinolone resistant isolates and penicillin tolerant isolates were detected in both Macrolide resistant and susceptible isolates. The susceptibility of S. pyogenes isolates to antimicrobials was varied in respect to their susceptibility or resistance to macrolide as well as to the phenotypes of resistant isolates.

دراسة تاثير الغشاء الحيوي المنتج بواسطة Klebsiella pneumonia المعزولة سريريا على بعض جوانب الجهاز المناعي == Study the Effects of Biofilm of Klebsiella pneumoniae Isolated Clinically on Some Immune System Aspects

Author name: سرى مؤيد عباس العبيدي

Supervisor name: علي حسين علوان العامري

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تعد بكترياKlebsiella pneumoniae من الممرضات الخطرة التي بامكانها ان تسبب اصابات حادة, شملت الدراسة عزل 50 عزلة من البكتريا من مصادر سريرية مختلفة من مستشفيات مختلفة في مدينة بغداد (مستشفى ابن البلدي, مستشفى الكندي التعليمي والمختبرات التعليمية لمدينة الطب) لغرض دراستها من محاور عدة بعد ان شخصت البكتريا اعتمادا على الطرق التقليدية بالتشخيص من حيث صفاتها الزرعية والكيموحيوية فضلا عن استعمل جهاز vitek2 compact system لتاكيد التشخيص, اظهرت نتائجنا ان عدد ونسبة عزلات بكترياKlebsiella pneumoniae التي تم الحصول عليها وفقا للمصادرالسريرية (الادرار,الدم ,القشع، حروق, مسحة الاذن ، القيح, الجروح والخروج) كانت 22 (44٪)، 11 (22٪)، 4 (8٪),4 (8٪), (3) (6٪)، 3 (6٪)، 2 (4٪) و1 (2٪) على التوالي. المحور الاول ركز على دراسة المقاومة للمضادات المختلفة وتحديد التركيز الادنى للمضادات الحيوية لتثبيط نمو البكتريا, استعملت المضادات الاتية (,amikicin, azteronam cefepime ceftazidime, ciprofloxacin, gentamycin, impenem, meropenem, minocycline, piperacillin, piperacillin/tazobactam, ticracillin, tobaromycin (trimethoprim/ sulfamethoxazole and لوحظ ان المضادات amikicin, impenem meropenem and اكثر فاعلية ضد هذه البكتريا. من جهة اخرى اظهرت العزلات قدرة مختلفة على انتاج الغشاء الحيوي، حيث استخدمت في هذه الدراسة طريقتان لمعرفة قدرة العزلات لتشكيل الغشاء الحيوي، وكالتالي كانت النسبة في طريقة Congo - Red Agar (CRA) 72 % مكونة للغشاء و20 % غير منتجة و8 % غير محددة الانتاجية, في حين طريقة اطباق المعايرة الدقيقة 80 % مكونة و20 % غير قادرة على تكوين الغشاء. العزلات الاقوى لانتاج الغشاء الحيوي اختيرت لمعرفة مقاومتها للمضادين Ciprofloxacin and Meropenem لاجراء مقارنة المضادات بين الخلايا المفردة والخلايا المكونة للغشاء الحيوي, حيث اظهرت النتائج ان المقاومة للمضادات تصبح اكثر بحوالي 10 مرات بالنسبة للخلايا المكونة للغشاء الحيوي مقارنة مع الخلايا المفردة. المحور الثاني تضمن اجراء التجارب المناعية وشملت عملية الطهي وقياس الفاعلية القاتلة وعملية البلعمة, اجريت هذه التجارب على اكفا عزلتين من كل مصدر من ناحية تكوين الغشاء الحيوي والاكثر مقاومة للمضادات الحيوية, من ناحية اخرى عرضت هذه العزلات لمصدر الاشعة فوق البنفسجية بطول موجي 240 نانوميتر ولمدة نصف ساعة وذلك لاجراء مقارنة بين العزلات نفسها قبل وبعد التعرض وتاثير ذلك على استجابة الجهاز المناعي داخل وخارج الجسم الحي. حيث اظهرت التحليلات الاحصائية وجود فروق عند مستوى معنوية (0.001) لعملية الطهي وقياس الفاعلية القاتلة (داخل الجسم الحي) والبلعمة (خارج الجسم الحي) عند المقارنة مابين العزلات قبل وبعد التشعيع ومابين البكتريا في حالة كونها خلايا مفردة وفي حالة تكوينها الغشاء الحيوي, يدلل ذلك ان الجهاز المناعي اكثر فاعلية ضد الخلايا المفردة من الخلايا المكونة للغشاء الحيوي وللعزلات نفسها قبل وبعد التشعيع.اخيرا اجريت دراسة للتحري عن نسبة وجود الجينات التي يعتقد انها مسؤولة عن انتاج الغشاء الحيوي بواساطة جهاز تفاعل البلمرة التسلسلي وكانت النسبة للجين mrkA 92% وللجين mrkD 50% في العزلات الغير مشععة واصبحت النسبة 53% MrkA و23% MrkD للعزلات بعد التشعيع. كخلاصة هذه النتائج تؤيد ان الاستجابة المناعية ضد البكتريا المكونة للاغشية الحيوية هي اقل كفاءة والتي تضمنت في الدراسة عنها للخلايا المفردة ومما يعني نحن بحاجة لاجراء دراسات اخرى تشمل للجوانب المناعية الاخرى المتخصصة في استجابة الجهاز المناعي. | Klebsiella pneumoniae is a dangerous pathogens that can cause severe diseases. This study included the isolation of 50 isolates of bacteria from different clinical sources from different hospitals in Baghdad city (Ibn - albalady hospital, Teaching Al - Kindy hospitals and Teaching laboratory in medical city hospitals through August 2014 to December 2014) for the purpose of examination of several axes after confirmation the diagnosis of bacteria depending on traditional methods of diagnosis in terms of relying on cultural and biochemical characteristics then used vitek2 a compact system. These results showed that the number and percentage of isolate according to the sources (urine, blood, sputum, burns, ear swabs, pus, wounds and stool ) were 22(44%), 11(22%), 4(8%), 4(8%), 3(6%), 3(6%), 2(4%) and 1(2%) respectively. The first axis of this studies focused on the isolates resistance to different antibiotics and determination the minimum inhibitory concentration of antibiotics ( amikicin, azteronam, cefepime, ceftazidime, ciprofloxacin, gentamycin, impenem, meropenem, minocycline, piperacillin, piperacillin/tazobactam, ticracillin, tobaromycin, trimethoprim/ sulfamethoxazole) that inhibits the growth of bacteria, the obtained results showed that the antibiotics amikicin, impenem and meropenem more effective against the isolates. On other hand the isolates showed different ability to produce biofilms, to examine this ability two methods were used (Congo - red agar methods and Tissue culture plate methods), the percentage of isolates formed biofilms in method (CRA) 72% produce biofilm and 20% non productive and 8% non - specific in CRA, while in TCP method 80% composed and 20% are not able to form the membrane. Higher production of biofilms isolates were exposed to Ciprofloxacin and Meropenem to make a comparison the antibiotic resistance between planktonic and biofilms producers isolates, the results showed that resistance to antibiotics became 10 times higher than planktonic. The second axis was the immunological experiment which included opsonization, bactericidal activity and phagosytosis. The strongest isolates that were chosen from each sources depended on biofilms formation, and antibiotic resistance, the same isolates were exposured to radiation by UV light wave length 240nm for 30min to compare between the same isolates after and before radiation to determine the immune response. Statistical analysis showed a significant differences P (0.001) to all immunogical experiments opsonization and bactericidal (preformed in vivo for wild and mutant type) activity phagocytosis (preformed in vitro for bacteria in planktonic and biofilm form). The immune system response was more effective against planktonic than biofilms formation bacteria to phagocytosis and between isolates for bactericidal assay and opsonization after and before radiation. Finally the genetic study used serial polymerase chain reaction to determine the proportion of the presence of genes that are believed to be responsible of biofilm production ratio was mrkA 92% and mrkD 50% of wild isolates that became at ratio 53.8% mrkA and 23% mrkD in isolates after radaiation, as a conclusion these findings support that immune response to bacteria vital constituent of membranes differ from the response in the case of single cells and there is need to make other immunological studies include specialized aspects of the immune system response.

تحضير الدقائق النانوية لاوكسيد واوكزالات النحاس ودراسة فعاليتها ضد بكتريا الزوائف الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسيلين المعزولة من اصابات الحروق والجروح == Preparation of Copper Oxide and Oxalate Nanoparticles and Their Effects Against P.aeruginosa and Methicillin - Resistant S.aureus from Burn and Wound Infections

Author name: سرمد فاروق هادي

Supervisor name: سوزان سعدي حسين الروزنامجي

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Master

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: جمعت ست وثمانون عينة سريرية (57 من الجروح و29 من الحروق) من مرضى مصابين بانواع مختلفة من الجروح والحروق من ثلاث مستشفيات في مدينة بغداد وهي : مستشفى اليرموك التعليمي ومستشفى بغداد التعليمي ومستشفى الحروق في مدينة الطب خلال الفترة من ايلول الى كانون الاول 2014. العينات المجموعة فحصت باستخدام ملون كرام ثم زرعت على اوساط اكار الدم واكارالماكونكي بالاضافة الى الاوساط التفريقية الانتقائية (وسط اكار السيدوموناس لعزل Pseudomonas aeruginosa ووسط المانيتول الملحي لعزل (Staphylococcus aureusكما اجريت الاختبارات الكيموحيوية التالية : الكاتاليز والاوكسديز والكواوكيوليز واختبار API 20 NE لغرض تشخيص الـ P.aeruginosa بالاضافة الى ذلك، وبالاعتماد على نظام VITEK2 compact تم اجراء الاختبار التاكيدي لتشخيص P.aeruginosa وS.aureus كشف الزرع البكتيري لـ 86 عينة الماخوذة من الجروح والحروق، ان 75 عينة )%87.2 ( وجد فيها نمو بكتيري هوائي (عينات ايجابية)، بينما العينات السلبية كانت (11) ونسبتها 12.8 %. اظهر زرع عينات الحروق والجروح نسبة عالية %)45.3 ( ,34 عزلة من P.aeruginosa وبالتالي اقترح ان يكون هو المسبب المرضي الاكثر شيوعا، بينما S. aureus كانت نسبتها 28.0 % (21 عزلة). تم زرع جميع عزلات S. aureusعلى وسط agar CHROM حيث سجلت 66.6 %منها كانت مقاومة للمثسيلين اي Methicillin Resist Staphylococcus aureus (MRSA) و33.3 % حساسة للمثسيلين ايMethicillin Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) ، نفس النتائج اعلاه تم الحصول عليها باستعمال طريقة Cefoxitin disc diffusion. خضعت 34عزلة عائدة لبكتيريا P.aeruginosa لاختبار فحص الحساسية للمضادات الحياتية قيد الدراسة، واظهرت النتائج ان كل العزلات %100.0كانت مقاومة للمضادات Carbenicillin وDoxycycline في حين اظهرت مقاومة عالية نسبيا للمضادات الاتية Amoxicillin /Clavulanic acid % 85.3% Cefipime , , 82.4 Netilmicin 76.5% واخيرا Azetreonam 61.8% في حين اظهرت مقاومة معتدلة نسبيا لكل من Gentamicin ,35.3% Tobramycin 32.4% واخيرا Ciprofloxacin ,29.4 % بينما اظهرت مقاومة منخفضة نسبيا لمضاد% Imipenem 14.7 . من جهة اخرى, خضعت 21 عزلة عائدة لبكتريا S.aureus لاختبار فحص الحساسية للمضادات الحياتية واظهرت مقاومة عالية نسبيا لكل من Azithromycin ; 76.2% Cefoxitin Clathromycin; 66.7% 62.0% في حين اظهرت مقاومة معتدلة نسبيا لكل من Chloramphenicol ,%47.6 42.9% Ciprofloxacin Doxycycline, 38.0% بينما اظهرت مقاومة منخفضة نسبيا لكل من Gentamycin , 19.0% Tobramycin Vancomycin , 14.3% 9.5% واخيرا Clindamycin . 9.5% تم تحضير دقائق نانوية لاوكسيد النحاس واوكزالات النحاس بنجاح بطريقة كيمياوية مرنة مستندة على التفكك الحراري لمواد اولية من حامض الاوكزاليك. تم تشخيصها باستعمال الطرق التالية : التحليل النمطي من انحراف الاشعة السينية (XRD) ، والمجهر الالكتروني الماسح (SEM) والتحويل الرباعية لامتصاص الاشعة تحت الحمراء(FT - IR) . تم قياس الفعالية المضادة للبكتيريا لاوكسيد النحاس واوكزالات النحاس النانوية المحضرة لكل من P.aeruginosa وMRSA باستعمال طريقة الانتشار في الحفر وطريقة تخفيف المرق. بينت النتائج بان كلا النوعين من الدقائق النانوية لها القدرة على منع نمو عزلات البكتيريا تحت الدراسة. كما تم تحديد التركيز المثبط الادنى MIC والتركيز القاتل الادنى MBC لكلا النوعين من الدقائق النانوية حيث كانت قيم MIC وMBC لاوكسيد النحاس ضد P.aeruginosa في التراكيز 1600 و3200 مايكروغرام/مل على التوالي، في حين كانت قيم MIC وMBC لاوكزالات النحاس في التراكيز 800 و1600 مايكروغرام/ مل على التوالي. اما بالنسبة لـ MRSA فان قيم MIC وMBC للدقائق النانوية لاوكسيد النحاس كانت في التراكيز 800 و1600 مايكروغرام/مل على التوالي، بينما كانت قيم MIC وMBC لاوكزالات النحاس النانوية في التراكيز 200 و400 مايكروغرام/مل على التوالي. | Eighty six clinical samples (57 wounds and 29 burns swabs) were collected from patients with different types of wounds and burns from hospitals in Baghdad City : Al - Yarmuk Teaching Hospital, Baghdad Teaching Hospital and Burn Hospital in Medical City at a period between September to December 2014. The collected samples were examined by Gram stain then cultured on Blood agar and MacConkey agar media, as well as differential selective media including Pseudomonas agar for isolation of Pseudomonas aeruginosa and Mannitol salt agar for isolation of Staphylococcus aureus bacteria. The following biochemical tests were performed : catalase, oxidase, coagulase tests, and API 20 NE in order To diagnose P.aeruginosa. Additional, Confirmatory test was performed by using VITEK2 compact system in order To identify P.aeruginosa and S.aureus. The results of bacterial cultures revealed that out of 86 samples obtained from burns and wounds, 75 samples forming 87.2 % were observed to have an aerobic bacterial growth (positive samples), while negative samples, (11) represented 12.8%. The results of bacterial culture from burn and wound samples revealed high percentage of 45.3% of P.aeruginosa (34 isolates). Hence, it was suggested to be the most common pathogen, while S.aureus represent 28.0% (21 isolates). All isolates of S.aureus were cultured on CHROM agar medium which revealed that 66.6 % of them were Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and 33.3% Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA), the same results were obtained by using Cefoxitin Disc Diffusion method. The Antibiotic sensitivity test on thirty four isolates of P.aeruginosa showed that all isolates 100.0% were resistant to Carbenicillin and Doxycycline; relatively high resistance to Amoxicillin/Clavulanic acid, 85.3 %; Cefipime, 82.4 %; Netilmicin, 76.5 % and Azetreonam, 61.8 %. These isolates have relatively moderate resistance to Gentamicin, 35.3%; Tobramycin, 32.4%; Ciprofloxacin, 29.4%, and relatively low resistance to Imipenem, 14.7 %. On the other hand, (21) isolates of S.aureus were tested for antibiotics sensitivity, indicating relatively high resistance to Azithromycin, 76.2%; Cefoxitin, 66.7% and Clathromycin, 62.0%. They also have relatively moderate resistance to Chloramphenicol, 47.6%; Ciprofloxacin, 42.9%, Doxycycline, 38.0% and relatively low resistance to Gentamycin, 19.0%; Tobramycin, 14.3%; Vancomycin, 9.5 % and Clindamycin, 9.5%.Copper oxide and oxalate nanoparticles were prepared successfully via soft chemistry route based on the thermal decomposition of oxalic precursors. They were obtained with a well - controlled morphology and particle size. These nanoparticles were characterized by using : X - ray diffraction (XRD) pattern analysis, Scanning Electron Microscope (SEM) and Fourier Transform Infra - Red spectroscopy (FT - IR). The antibacterial activity of the obtained copper oxide and oxalate nanoparticles against P.aeruginosa and MRSA were estimated by using Well Diffusion and Broth Dilution methods. The results showed that both types of nanoparticles have the ability to inhibit growth of the bacteria under study. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericidal Concentration (MBC) of copper oxide nanoparticles against P.aeruginosa were found to be 1600 and 3200 µg/mL respectively, while for copper oxalate nanoparticles were at concentrations of 800 and 1600 µg/mL respectively. For MRSA, the MIC and MBC values of copper oxide nanoparticles were at concentrations of 800 and 1600 µg/mL respectively, while for copper oxalate nanoparticles were at concentrations of 200 and 400 µg/mL respectively

استخلاص وتنقية جزئية للكتينات بكتريا Pseudomonas aeruginosa المعزولة من حالات مرضية

Author name: زينب نوري حامد محمد العاني

Supervisor name: عبد الواحد باقر الشيباني | خليل مصطفى خماس

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Doctorate

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تم جمع (50) مسحة تعود لمرضى ومراجعين لثلاث مستشفيات عامة في بغداد وذلك للتحري عن عزلات الـ Pseudomonas aeruginosa اخذت من حالات مرضية متعددة شملت الحروق والجروح والتهابات الاذن. وبعد ان اجريت على العزلات التي تم الحصول عليها الاختبارات الكيموحيوية اللازمة لتشخيصها ومنها القابلية على تحليل الدم على وسط الـ Blood agar ، امكن انتقاء (25) عزلة اظهرت قدرتها على انتاج انزيم الـ hemolysinase وتحليل وسط الدم بشكل كامل. اخضعت العزلات بعدها لاختبار القابلية على النمو على وسط السترمايد الانتقائي والقدرة على النمو في 42 م ، اذ انتخبت (18) عزلة منها. ثم تبع ذلك اختبار قابلية العزلات على انتاج اللكتينات من خلال عملية التلازن مع كريات الدم الحمر للانسان بفصائلها (O, B, A) ودم بعض الحيوانات _الماعز ، الدجاج ، الفئران والارانب) حيث تم انتقاء العزلات التي اعطت اعلى عيارية. زرعت العزلات على وسطي الانتاج (GE) Grelets mediumوالمرق المغذي (Nutrient broth) للتحري عن قابليتها على انتاج اللكتينات، ودلت النتائج على انتاجها لنوعين من اللكتينات هما PA - I والـ PA - II ، اذ يتميز الاول بتخصصه تجاه سكر الكالكتوز، فيما يتخصص الثاني بالمانوز. بعد انتهاء فترة التنمية تم استخلاص اللكتينات من اوساط الانتاج لتجري عليها عملية التنقية باستخدام كبريتات الامونيوم ثم التكسير بالموجات فوق الصوتية ، ليتم بعدها انزال الراشح باستخدام طريقة الفصل بكرموتوغرافي عمود الفصل يمكن تلخيص اهم النتائج التي تم الحصول عليها بالاتي : 1 - اظهرت مستخلصات اللكتينات تباينا في الفاعلية التلازنية تجاه كريات الدم الحمر للانسان والحيوان سواء اكانت معاملة بانزيم التربسين ام لم تعامل به، كما تباينت العزلات في انتاجها لانزيم الهيمولايسين وصبغة البايوسين الزرقاء. 2 - تم تحديد درجة الحرارة المثلى لنمو عزلات بكتريا الـ aeruginosa P. وانتاجها للكتينات ب37م عندما بلغ تركيز اللكتين PA - I 95 مايكروغرام / سم3 ، في حين كان تركيزه عند الحرارة 35 م مايكروغرام/ سم3. اما اللكتين PA - II فبلغ تركيزه 40 مايكروغرام / سم3 عند الحرارة 35 م . 3 - وكان لاختلاف الاس الهيدروجيني دور في التاثير على تركيز ونقاوة اللكيتنات المستخلصة. اذ لم يتجاوز تركيز اللكتين PA - II المستخلص من العزلة (Z1) الـ30 مايكروغرام / سم3 عند الاس الهيدروجيني 5.0 في حين بلغ التركيز 105 مايكروغرام / سم3 لنفس اللكتين عند الاس الهيدروجيني الامثل (7.0) . اما اللكتينPA - I فقد انخفض تركيزه من 85 مايكروغرام/ سم3 في الاس الهيدروجيني الامثل ليصل الى35 مايكروغرام / سم3 عند الاس الهيدروجيني 8.0. 4 - تمت تنقية اللكتينات المستخلصة بطريقة الترحيل الكهربائي في هلام متعدد الاكريلامايد بظروف ماسخة ، من خلال تمرير اربعة نماذج مستخلصة (اضافة الى نموذج البروتينات القياسي). 5 - لدى اختبار حساسية العزلات المعزولة من التهابات الاذن لمضادات الحياة ، اظهرت تباين في مقاومتها للمضادات، وكانت جميع العزلات مقاومة لكل من الامبسلين والاموكسيسيلين، فيما كانت حساسة للمضادات توبرومايسين والجنتامايسين والارثرومايسين. 6 - لاختبار قابلية اللكتينات المستخلصة على الارتباط بالسكريات الموجودة في حليب الام وحليب البقر والحليب المصنع، دلت النتائج بانه اضافة عالق الدم صنف O الى اللكتين مع سكريات الحليب تاركا كريات الدم الحمر حرة. 7 - اثبتت تجربة استخدام المرهم الطبي المضافة له بعض السكريات البسيطة كفاءتها، بعد ان تبين قدرة هذه السكريات على تثبيط تلازن اللكتينات مع كريات الدم الحمر للانسان خارج الجسم.8 - بعد ان حقنت فئران التجارب باللكتينات (PAI,PA - II,PAII) المستخلصة من العزلات (Z4,Z1,Z1) ، كان المحتوى الكاربوهيدراتي فيها (95،48، 30) مايكروغرام/سم3 وتركيز البروتينات (1350،860، 590) مايكروغرام / سم3 على التوالي. كما ولوحظ ظهور حالات غريبة على الفئران الثلاثة في المجموعة الاولى والتي حقنت باللكتينات اعلاه وتركت بدون علاج لمدة ساعة، ما بعد قتلها فقد حدث تحلل دم كامل في الفار الاول ومتوسط في الثاني، في حين لم يحدث اي تحلل للدم في الفار الثالث. وبعد استخدام العلاج في فئران المجموعة الثانية، لم يحدث تحلل دم للفار الاول والثالث وكان التحلل ضعيفا في الثاني. اما فئران المجموعة الثالثة والتي حقنت وتركت لمدة ساعتين بدون علاج، فقد نفق الفار الاول وحدث تحلل ضعيف في دم الفار الثاني وتحلل كامل في الفار الثالث. لم يسبب اعطاء العلاج لفئران المجموعة الرابعة وتركهم لمدة ساعتين اي تحلل لدم الفار الاول والثالث فيما كان ضعيفا في الثاني. اما افراد المجموعة الثانية فقدتركت بعد الحقن ثلاث ساعات بدون علاج، وكان تحلل الدم كاملا في الفار الاول ومتوسطا في الثاني والثالث، في حين لم يحدث تحلل للدم بعد اخذ العلاج. | Fifty samples were collected from several pathogenic cases including burns, wounds and ears belonging to patients and individuals referred to three general hospitals in Baghdad. Samples were subjected to the microbiological tests for detecting Pseudomonas aeruginosa, isolales. Among those tests was the ability of blood analysis on blood agar base medium. A total of (25) isolates were selected which showed the ability to produce the hemololysins. Some suspected isolates were also subjected to grow on ctramide agar, and with stand growth at 42c. Out of (25) only (18) isolate selected due to their ability to grow at 42c. The (18) selected isolates were tested for their ability to produce lectins via the heamagglutination with the human red blood cell groups (A, B, O). Isolates showed higher titers were chosen, when ability to produce lectins, two types (PA - I and PA - II) lectins were detected. Lectin PA - ICharacterized by it’s specify toward galactose, while PA - II was specific to mannose. After lectins were extracted from the production media, they were purfeyed by using ammonium sulphate and fractioned by the ultrasonic waves, followed by descending the filtrate by separation, through the chromatographic column.Results obtained could be described briefly as : 1. Obtained lectins showed were differed in their haemagglutination activity toweras human and animals red blood cells whether they were treated by the trypsin enzyme or not. However, isolates were not similar in producing the hemolysin enzyme and pyocine pigment.2. Optimum temperature for growth of P. aeruginosa isolate, and lectins production was 37c when concentration of lectin PA - I reached 95.0 µg/ml, while at 35c was 35 µg/ml - Regarding PA - II reached 40 µg/ml at 35c.3. Variation of pH played a significant effect on the. concentration and purity of the extracted lectins. At pH5.0 lectin PA - II concentration did in exceed 30, µg/ml while at optimum pH (7.0) it reached 105 µg/ml in the optimum pH to only 35 µg/ml at pH 8.0.4. Extracted lectins purified by gel electrophoresis when four extract in addition to the standard proteins sample were passed through it. The molecular weight of the PA - I was lectin from Z1 was 14.000 Dalton, while PA_II was 12.000 Dalton from the same sample.5. When P. aeruginosa isolates of ear infection were tested for their susceptibility to some antibiotics, they differed in their pattern of resistance. However, all isolates were resistant to Ampicilin and Amoxocilin, but sensitive to Tobramycin, Erythromycin and Gentamycin.6. In order to test the ability of the extracted lectin against some sugar which present in the human milk, raw milk and powder milk, red blood cell group were added to the lectin with the milk samples. Results showed that sugars inhibited haemagglutination with the red blood cells. 7. Experiments and application of the prepared ointment containing simple sugar proved its efficiency when sugar were able to prevent lectin agglutination with human red blood cells (invitro).8. After injecting mouse with the lectins (PAI, PAII, PAII) at (Z1, Z1, Z4) isolates, concentration of CHOs were (30, 48, 95) µg/ml and protein were (135, 860, 590) µg/ml respectively. Abnormal cases were also appeared on the three mice at the first group which was injected by the lectin when they were left without treatment for one hour, after they were killed, the first one was showed complete analysis at red blood cells, while it was not complete in the second and no analysis was showed in the third one, after treatment, no analysis of red blood cells was showed in the first and the third one, but it was not complete in the second one.The third group which injected by the same lectins when they were left without treatment for two hours the first mouse was dead, and the hemolysis was not completed in the second one, but completely in the third one, after treatment no hemolysis was showed in the first and the third one, but weakly in the second one. The fourth group, which injected by the lectins when they were left without treatment for three hours, the first mouse, was showed complete hemolysis, but not complete in the second and third one, after treatment, no hemolysis of red blood cells was showed.