دراسة وراثية للبكتريوسين المنتج من بكتريا Klebsiella spp. المعزولة من مصادر سريرية مختلفة
Author name:
علاء سالم حمزة حبيب
Supervisor name:
رياض عبد الحسين دلول
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3364 - p.pdf
Abstract:
تضمنت الدراسة جمع (200) عينة سريرية توزعت الى (50) عينة ادرار و(50) عينة قشع و(50) عينة من التهابات الاذن الوسطى و(50) عينة من اصابات الجروح والحروق، ومن خلال نتائج الزرع البكتريولوجي على اوساط اكار الماكونكي واكار الدم ووسط Eosin Methylen Blue , والتشخيص المظهري والكيموحيوي، وتاكيد التشخيص باستخدام نظام API20E ، تم الحصول على( 40 ) عزلة تعود لبكتريا Klebsiella. توزعت الى 20 عزلة تعود للنوع K.pneumoniae و(11) عزلة للنوع K.oxytoca و(9) عزلات تعود للنوع K.planticola . تم الكشف عن مدى قابلية العزلات على انتاج البكتريوسين بثلاث طرائق تضمنت : طريقة الحفر (wells)، وطريقة اقراص الاكار cup assay))، وطريقة التخطيط المتقاطع ( (cross - streaking assay. وتم الحصول على سبع عزلات منتجة للبكتريوسين . تم استخلاص البكتريوسين بنوعيه المرتبط بالجدار وغير المرتبط بالجدار , واظهر البكتريوسين الخام المرتبط بالجدار فعالية عالية مقارنة بالبكتريوسين غير المرتبط بالجدار , وكانت فعالية البكتريوسين المرتبط بالجدار (5120) وحدة/مل، وكان تركيز البروتين (4000) مكغم/مل وقطر منطقة التثبيط (20) ملم , بينما كانت الفعالية للبكتريوسين غير المرتبط (320) وحدة/مل وتركيز البروتين (500 )مكغم/مل وقطر منطقة التثبيط (15) ملم . اظهر البكتريوسين الخام المرتبط بالجدار تاثيرا على مجموعة من البكتريا المرضية تضمنت Enterobacter sakazaki ، Shigella flexneri، E. coli، Acinetobacter baumannii ، Enterobacter aerugenes ، K.planticola Proteus mirabilis ، Serratia marcescens، Enterococcus fecalis ، Staphylococcus aureus . ولم يظهر البكتريوسين فعالية على Enterococcus faecalis ، Serratia marcescens ، Proteus mirabilis ، Pseudomonas aeruginosa تم اجراء فحص الحساسية لمضادات الحيوية للعزلات البكتيرية المنتجة للبكتريوسين، فقد تم استخدام (13) مضادا حيويا شملت كل من ( Cefotaxim وGentamycin وNorfloxacinو Nitrofurantoinو Amikacinو Ampicillin وTrimethoprimو Pipracillinو AztreonamوImipenem وCiprofloxacin وAugmentin وCephalexin ) وتم اختيار العزلات الاكثر مقاومة لهذه المضادات لاكمال الجانب الوراثي . تمت دراسة المحتوى البلازميدي للعزلات الاربعة (K2, K4, K20,K38) التي كانت اكثر مقاومة لمضادات الحيوية , وبينت النتائج احتواء العزلة(K4 )على حزمتين بلازميديتين، اما العزلات الاخرى فقد احتوت على حزمة بلازمية واحدة , ثم اجريت عملية تحييد الدنا البلازميدي باستخدام مادتي SDS ومادة Acridin orange , لم تنجح مادة SDS في تحييد الحزم البلازميدية , بينما نجحت مادة Acridin orange في تحييد الحزم البلازميدية عند تركيز (512) مايكروغرام/مل .تم التحري عن قابلية العزلات المحيدة على انتاج البكتريوسين والمقاومة لبعض مضادات الحيوية المستخدمة في الدراسة واظهرت النتائج فقدان العزلات (K2, K4, K38) لصفة انتاج البكتريوسين، واحتفاظ العزلة ((K20 بصفة انتاج البكتريوسين. بالنسبة لمضادات الحيوية , احتفظت العزلات بمقاومتها لمضادات Ciprofloxacin وNorfloxacin وTrimethoprim , اما بقية المضادات والتي شملت كل من Pipracillin وAztreonamو Ampicillin وCefotaximو Gentamycinو Nitrofurantionو Amikacinو Cephlexin وAugmentin، فقد اصبحت العزلات حساسه لها.اجري فحص الاقتران البكتيري بين العزلات (K2, K4, K20,K38) والعزلة القياسية E.coliMM294, وقد نجحت العزلتان ( K2, K4) في تحقيق عملية الاقتران بينما فشلت العزلتان (K20,K38) في تحقيق عملية الاقتران , وقد اكتسبت العزلة القياسية صفة انتاج البكتريوسين والمقاومة لمضادات الحيوية قيد الدراسة . | The study included (200) clinical sample, (50) urine,(50) sputum , (50) sample of otitis media and (50) sample with injuries and burns. Morphological and biochemical tests were employed to diagnose bacterial species and the results showed they were (40) isolates.They were (20) K.pneumoniae ,(11) isolates of K.oxytoca and(9) isolates of K.planticola. The ability of isolates to produce bacterocin were detected by three methods included the methods of wells, cup assay method, and cross - streaking assay. Results revealed that(7) isolates were able to produce bacteriocin.The wall - degraded bacteriocin was (5120) unit\ml, and protein concentration was (4000) μg/ml and the diameter of inhibition area was 20mm, while non wall - degraded was (320)unit\ml and the protein concentration (500) µ\ml and the inhibition area (15) mm. The effect of crude bacteriocin on some clinical isolates including Enterobacter sakazakii,S.auereus, K.oxytoca , Shigella flexneri, E. coli, Acinetobacter baumannii, K. planticola and Enterobacter aerogenes was studied. The results showed thier was effect on the above isolates, while the isolates of Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterococcus fecales and Ps.aeruginosa were resistant to bacteriocin. Sensitivity of isolates that produced the bacteriocin was tested against (13) antimicrobial agents included (Cefotaxime, Gentamycin, Norfloxacin, Nitrofurantoin, Amikacin, Ampicillin, Trimethoprim, Pipracillin, Aztreonam, Ciprofloxacin, Imipenem ,Augmentin and Cephalexin). Results revealed that four isolates were resistant to the antibiotics. The plasmid content of the four isolates (K38, K20, K4, K2) which were the most resistant to the abovementioned antibiotics was studied ,The results showed That these isolates contain plasmids of different molecular weight. Curing was conducted by the use of SDS and Acridin orange. The isolates lost the plasmids at concentration 512µg/ml of Acridin orange. The production of bacteriocin and the resistance of the four selected isolates to the antibiotics were studied. The results showed that three of the examined isolates were unable to produce bacteriocin, they were (K38, K4, K2).The fourth isolate(K20) was able to produce bacteriocin.The four isolates appeared to resist the antibiotics Trimethoprim, Ciprofloxacin and Norfloxacin, while they were sensitive to the other antibiotics. The bacterial conjugation between (K38, K20, K4, K2) isolates and the standard strain E.coli MM294 was studied. The results showed That (2) isolates (K4, K2) were successful in transferring plasmids , while the other two (K20, K38) failed. The transconjugants were able to produce bacteriocin and resist Antibiotics.
