Share
دراسة وراثية وجزيئية لعزلات محلية مرضية من بكتريا Klebsiella المقاومة للمعادن الثقيلة والمنتجة لانزيم B - Lactamase == A Genetic and Molecular Study of Local Pathological Isolates from Klebsiella Resistant to Heavy Metal and Productive of ? - Lactamase Enzymes
Author name:
صلاح مهدي حسن السعدون
Supervisor name:
سوسن ساجد محمد علي الجبوري | نزار ادور ناصر
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3367 - p.pdf
Abstract:
تضمنت هذه الدراسة جمع (536) عينة ادرار من مرضى يعانون من التهاب المجاري البولية من اربعة مستشفيات في بغداد للفترة الواقعة من 22/12/2004 - 27/5/2005.2 - من خلال نتائج الزرع البكتريولوجي الاولي استطاعت (286) عزلة (63.8%) من النمو باستخدام وسطي اكار الماكونكي واكار الدم وقد كان من بينها (85) عزلة مخاطية وبنسبة (29.7%)، فيما اظهرت نتائج التشخيص المورفولوجي والكيموحيوي للعزلات المخاطية ومن خلال نتائج استخدام نظام Api 20E عائدية (36) عزلة الى جنس الكلبسيلا، توزعت مابين (18) عزلة للنوع K.planticola K.pneumoniae و(7) و(6) عزلات للنوع عزلات للنوع K.terrigena و(4) عزلات للنوع K.oxytoca و(1) عزلة للنوع K.ornithinolytica. 3 - تم التحري عن عدد من عوامل الضراوة لانواع الكلبسيلا، اذ اظهرت نتائج الفحص المجهري باستعمال طريقة التصبيغ السالب ان العزلات جميعها (100%) محاطة بمحفظة، كما بينت جميع العزلات (100%) عدم قدرتها على انتاج الهيمولايسين، بينما اظهرت (61.1%) من العزلات قدرتها على انتاج السايدروفورات بنموها في الوسط الحاوي 2 - 2 ثنائي بايريديل (M9)، واظهرت جميع العزلات ايضا (100%) قابلية الالتصاق بالخلايا الطلائية المعزولة من ادرار اناث صحيحات، فيما كان (66.6%) من العزلات منتجة للبكتريوسين.4 - اختبرت قابلية العزلات على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز باستخدام الطريقة اليود القياسية السريعة، اذ اظهرت (23) عزلة (63.8%) قدرتها على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز بهذه الطريقة، بفترات تراوحت مابين اقل من دقيقة الى (5) دقائق.5 - اختبرت قابلية العزلات على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف باستخدام الطريقة الثلاثية الابعاد (غير المباشرة)، واظهرت النتائج بان 18 عزلة من مجموع 36 (33.3%) لها القدرة على انتاج انزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف توزعت مابين 5 عزلات من مجموع 18 (27.7%) للنوع K.planticola و3 عزلات من مجموع 6 (50%) للنوع K.pneumoniae وعزلتان من مجموع 7 (28.5%) للنوع K.terrigena وعزلة واحدة من مجموع 4 (25%) للنوع K.oxytoca وعزلة واحدة فقط من مجموع 1 (100%) للنوع K.ornithinolytica.6 - اجري اختبار الحساسية للمضادات لجميع العزلات تجاه (24) مضادا للحياة، لقد اظهرت جميع العزلات نمط المقاومة المتعددة، اذ كانت (100%) من العزلات مقاومة للامبسلين والكاربنسلين والببراسلين والسيفالوكسين، بينما كانت العزلات جميعها حساسة للاميكاسين والسفيبيم والاميبينيم والنورفلوكساسين، فيما تفاوتت نسب المقاومة لباقي المضادات.7 - حددت التراكيز المثبطة الدنيا لعدد من البنسلينات والسيفالوسبورينات ومجموعة الامينوكلايكوسيدات والكينولونات وغيرها من المضادات، واظهرت النتائج ان هنالك اختلافا واضحا في قيم الـMIC بين الانواع البكتيرية المختلفة سيما المنتجة لانزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف، فقد استطاعت اغلب العزلات مقاومة تراكيز عالية من الامبسلين، والكاربنسلين والببراسلين والسسيفالكسين غير انه لم تستطع سوى عزلات قليلة وبضمنها المنتجة لانزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف من النمو في تراكيز عالية من الاميكاسين (AK)، والسيفيبيم (PEF)، والامبينيم (IMP)، والنورفلكساسين (NX)، والسيروفلكساسين (CF).8 - درست قابلية العزلات على تحمل تراكيز مختلفة من المعادن الثقيلة وذلك بانمائها على اوساط ضمت تراكيز مختلفة من تلك المعادن. وقد اظهرت النتائج انخفاضا في مستوى تحمل البكتريا للمعادن الثقيلة، وكان هنالك اختلافا واضحا من بين تلك العزلات لتحمل معدن النحاس، الكروم، الكوبلت، الزنك، الكادميوم، الزئبق، الرصاص، الفضة. 9 - تمت دراسة محتوى الدنا البلازميدي لمجموعة من العزلات والتي اظهرت مديات عالية من المقاومة لمضادات الحياة والمعادن الثقيلة، وبينت النتائج احتواء معظم العزلات على اكثر من حزمة بلازميدية واحدة، بينما خلت بعض العزل من اي حزم وبذلك تصبح مقاومة للمضادات والمعادن الثقيلة فضلا عن انتاج انزيمات البيتالاكتاميز صفة الكروموسومية.10 - اجري فحص الاقتران البكتيري مابين عزلات منتقاة من انواع بكتريا الكلبسيلا اتسمت بمقاومتها العالية الى اكثر من مضاد وتحملها للمعادن الثقيلة فضلا عن انتاجها لانزيمات البيتالاكتاميز وبين السلالة القياسية E.coli MM294، وقد استطاعت 9 عزلات من مجموع 14 عزلة تحقيق عملية الاقتران بنجاح (وبنسبة 64.2%) فيما اخفقت 5 عزلات، واستطاعت الخلايا الاقترانية الناتجة من التزاوج من النمو على اوساط الاختبار الحاوية على مضادي الامبسلين والريفامبسين معا. 11 - تم التحري عن المحتوى البلازميدي للخلايا الاقترانية ووجد ان اغلب البلازميدات كانت قد انتقلت من السلالة الواهبة متمثلة بالعزلات قيد الدراسة الى السلالة القياسية، اذ استطاعت 7 عزلات اقترانية من مجموع 9 وبنسبة (77.7%) من اعطاء فحص انزيم البيتالاكتاميز موجب ونسبة (77.7%) لفحص التحري عن ESBLs. فضلا عن ذلك فقد انتقلت مقاومة مشتركة لاكثر من مضاد حيوي ومعدن ثقيل للخلايا الاقترانية مما يدل على ان هذه الصفات محمولة بلازميديا. | 1 - This study included the collection of 536 urine samples from patients suffering urinary tract infection from four hospitals located in Baghdad to the period between 22/12/2004 - 27/5/2005. 2 - Using MacConkey blood agar in primary bacterialogical culture, 286 isolates (63.84) were grown, among them 85 isolate (29.71) were mucoid. Result of morphological & Biochemical diagnosis besid using Api 20E showed there were 36 isolates related to genus Klebsiella. These comrised as K.planticola (18 isolates), K.terrigena (7 isolets) and K.pneumonia (6 isolates) & K.oxytoca (4 isolates) and one isolates of K.ornithinolytica. 3 - Some virulence factors of Klebsiella species were detected. Microscopic examination using negative stain revealed that all the isolates (100%) were capsulated, besid they were unable to produce heamolysine. While (16.1%) of the isolate were siderophore producer when they showed their ability to grow in 2 - 2 dipyridyl media (9M media). All the isolates (100%) showed adherence ability to epithelial cell isolated from urine of healthy women, whereas 66.6% of the isolates were bacteriocin producer. 4 - The rapid standard iodometric method was used for the dection of B - lactamase production. Results showed that 23 isolate (63.84) were B - lactamase producer and the time of positive results ranged from less than (1 - 5)mins. 5 - The indirect three - dimentional method was performed to detect the Extended - spectrum B - lacatamase (ESBLs). Results revealed that only 18 isolates (33.3%) were ESBLs producer. These comprised 5 isolated from 18 (27.7) to K.planticola, 3 isolates from 6 (50%) to K.pneumonia, 2 isolates from 7 (28.5%) to K.terrigena, one isolates from 4 (28%) to K.oxytoca & one isolate (100%) to K.ornithinolytica. 6 - Antibiotic sensitivity test was performed using 24 different antibiotic. All isolates showed multidrug resistance. Results showed that all the isolate (100%) were able to resist Ampicillin, Carbencillin, Piperacillin, Cephalexin, while they were sensitive towards Amikacin, Cefepime, Imepinem and Norflaxacin. Resistance rate to other antibiotic were variant. 7 - The minimal inhibitory concentration (MIC) for Penicillins & Cephalosporins, Aminoglycoside group, Qinolones & other antibiotics were determined. Considerable differences observed between the MIC for ESBLs producer isolates and the non - producer - both groups were able to resist high concentration of Ampicillin, Carbenicillin, Piperacillin & Cephalexin while only the ESBLs producer outcome of non - producer isolates were able to grow in considerable concentration of Amikacin, Cefepime, Imepinem, Norflaxacin & Ceprofloxacin. 8 - The ability to tolerate different concentration of heavy metals were studied by growing them in media containing different concentration of these metals. There were great differences & decreas & in the level of bacterial tolerance to heavy metals including (Cu, Cr, Co, Zn, Cd, Hg, Pb, Ag) while many isolates could not tolerate low concentration of copper nor chrome. 9 - Plasmid profile of some isolated specially these showed high antibiotic & heavy metal resistance were determined. Result showed that most of the isolates examined harboured more than one plasmid band. While some isolates were plasmidless, A condition implying that B - lactamase production, antibiotic & heavy metal resistance are under chromosomal control. 10 - Bacterial conjugation was performed between selected isolates of Klebsiella specially those with high antibiotic resistance, heavy metal tolerance, besid B - lactamase production and the standard strain E.coli MM294. There were (9) successful conjugation from 14 (64.2%). The transconjugant cells were able to grow of selective media containing both of Ampicillin & Rifampicin. 11 - Studying plasmid profile of transconjugated cells showed that most the plasmid were transferred from the donore (represented by bacterial isolated) to recipient (the stander stranted). Out of 9, 7 transconjugant cells (77.7%) gave positive result to B - lactamase production & ESBLs. In addition multidrug resistance & heavy metal tolerance were transferred to the transconjugant cells, a condition implying that they are plasmid mediated.
