التحري الجزيئي والتعبير الجيني لمضخات الدفق في بكتريا Pseudomonas aerugionsa متعددة المقاومة للمضادات الحيوية == The Role of Efflux Pumps in Multidrug - Resistance in Colistin - resistant Pseudomonas aeruginosa
Author name:
نبراس رضا محمد العبيدي
Supervisor name:
محمد فرج شذر المرجاني
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3435 - p.pdf
Abstract:
جمعت 120 عزلة تعود لبكتريا Pseudomonas aeruginosa للمدة من /15 2014/9 لغاية /11/15 2014, من مصادر سريرية مختلفة شملت : (33عزلة ) من الادرار , و(25عزلة) من الحروق , و(25عزلة ) من القشع , و(17عزلة) من الجروح , و(12عزلة ) من الدم, و( 5عزلات ) من الاذن , و(3 عزلات) من ادوات قثطرة المجاري البولية. اختبرت حساسية العزلات قيد الدراسة تجاه مضاد الكولستين باستعمال طريقة الاقراص واظهرت النتائج وجود 27) ) عزلة مقاومة للكولستين وبنسبة (%22.5) , ثم اختبرت مقاومة60 عزلة (منها 27 عزلة مقاومة للكولستين ) تجاه اثناعشر مضادا من مجاميع مختلفة وتم تحديد حساسية العزلات ومقاومتها للمضادات المايكروبية باعتماد قياس قطر منطقة التثبيط بالمليمتر حول اقراص المضادات المستعملة , واظهرت النتائج ان جميع العزلات المختبرة كانت مقاومة بشكل تام لمضادات Amoxicillin وCarbencillin بينما ابدت العزلات مقاومة لمضاداتGentamycin بنسبة (%70) و(%56.6) Tobramycin وLomefloxacin (%58.3)وكانت المقاومة اقل لمضادات Aztreonam (%18.3) وPolymyxin B بنسبة (%18.3) وتليها المقاومة لمضادNorfloxacin (%13.3)و Levofloxacin (%11.6) وتجاه Ciprofloxacin الاقل مقاومة بنسبة (%8.3) .اختبرت قابلية (60) عزلة اعلاه على انتاج انزيم البروتييز وتكوين الغشاء الحيوي واظهرت النتائج قابلية % 88.3 من العزلات 53) عزلة )على انتاج انزيم البروتييز, وكانت جميع العزلات المقاومة للكولستين منتجة لانزيم البروتييز وبنسبة %100 , من جانب اخر كانت 43 عزلة (%71.7) منتجة طبقة لزجة قوية محددة بوساطة تكوين مستعمرات سوداء دلالة على تكوينها الغشاء الحيوي .تم الكشف عن وجود مضخات الدفق بين 60 عزلة من عزلات الدراسة ( منها 27 عزلة مقاومة لمضاد كولستين و33 عزلة حساسة له) باعتماد طريقة العجلة الخشبية Ethedium Bromide - Agar Cartwheel Method (EtBr CW) باعتماد صبغة الاثيديوم برومايد كمؤشر للكشف عن مضخات الدفق , واظهرت النتائج ان 46 عزلة (76.7%) من العزلات المختارة اعطت نتيجة موجبة للفحص اعلاه , ومن جانب اخر كانت جميع العزلات المقاومة للكولستين موجبة للفحص مما يدل على امتلاكها لمضخات الدفق , اما بالنسبة للعزلات الحساسة للكولستين فكانت %33.3منها تملك مضخات دفق بالكشف المظهري . اخضعت 32 عزلة (27 منها كانت مقاومة للكولستين) للكشف الجيني عن مضخات الدفق باستعمال تقنية Conventional PCRللكشف عن مضخة الدفق MexAB - OprM (بالكشف عن جينات oprMو (mexAومضخة الدفق MexXY (بالكشف عن جين mexY) اظهرت النتائج ان20 عزلة (62.5%) تمتلك الجينoprM , وان 22عزلة (68.8%) تمتلك الجين mexA , و24 عزلة (75%) تمتلك الجينmexY , وبينت النتائج ايضا بخصوص الكشف الجيني عن مضخات الدفق لعزلات الدراسة ان جميع العزلات الموجبة لاختبار امتلاك الجين mexYهي مقاومة للكولستين وقد شكلت نسبة %88.9 من العزلات الكلية المقاومة للكولستين . وتم الكشف عن التعبير الجيني لمضخة الدفق OprM - MexAB (بدراسة الجين (mexB ومضخة الدفق MexXY ( بدراسة الجين mexX) في 9 من عزلات الدراسة والتي كانت مقاومة لمضاد الكولستين باستعمال تقنية q RT - PCR من خلال استخلاص RNA البكتيري , ومن ثم تحويله الى cDNA , واظهرت نتائج الكشف عن التعبير الجيني للجين mexB والجين mexXان العزلات كانت متباينة في قيم ct , وبحسب معادلة Livak تم استخراج قيم ct ومعرفة التعبير الجيني لمضخات الدفق , ولوحظ ان التعبير الجيني لمضخة الدفق MexXY اكثر من التعبير الجيني لمضخة الدفق MexAB - OprM . | A total of (120) clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa were collected from different sources , During the period between 15/9/2014 till 15/11/2014 . The source of these isolates were as follows : (33) isolates from urine , (25) isolates from Burns , (25) isolates from sputum , (17) isolates from Wounds , (12) isolates from Blood , (5) isolates from ears ,and the last (3) isolates from Catheters . All isolates were identified through morphological , cultural and some biochemical tests and using Vitek2 GN . The antibiotic susceptibility test Towrd Colistin was done using the agar diffusion method ; Results showed that 27 isolates (%22.5) were resistance to Colistin ,then Sixty isolates ( Ones 27 isolates resistance to Colistin ) were tested against twelve antibiotic by measuring inhibition zone around disk antibiotic , Result showed that All isolates were complete resistance to Amoxicillin and Carbencillin , While resistance to other antibiotic were Gentamycin (70%) , Tobramycin (56.6%) , Lomefloxacin (58.3%) , and less resistance was showed for Aztreonam(18.3%) , Polymyxin B (18.3%), Norfloxacin(13.3%) , Levofloxacin(11.6%) and Ciprofloxacin (8.3%) ,The most effective antibiotic against Colistin resistance isolates were Levofloxacin and Ciprofloxacin . Sixty of isolates were choosen to detect for ability to protease production and biofilm formation , The Results showed 53 isolates (%88.3) were protease production , and results showed all Colistin resistant isolates were protease production and 43 isolates (%71.7) were able to biofilm formation . Sixity isolates (Ones 27 Colistin resistance isolates ) were choosen for detect efflux pumps by using Ethedium Bromide - Agar Cartwheel Method (EtBr CW) , which include ethedium bromide dye as marker to detect efflux pumps , the result showed that 46 isolates (%76.7) give positive result . Polymerase Chain Reaction (PCR) technique was performed done using specific primer targeting the specific sequences of the mexA , mexY, oprM gene , The results showed that oprM found in 20 isolates (%62.5) , mexA found in 22 isolates (%68.8) , mexY found in 24 isolates (%75) , The results also showed that 88.9 % from Colistin resistant isolates had mexY gene . Detection of gene expression was performed done by using q RT - PCR technique after RNA extraction of Colistin resistant isolates and c DNA synthesis , The results showed that gene expression were high in efflux pumps especially to MexXY efflux pumps , and the gene expression to MexXY efflux pumps higher than MexAB - OprM efflux pums
