تاثير الكليبوسين المنقى جزئيا من البكتريا المعزولة محليا Klebsiella pneumoniae على بعض البكتريا المعوية وعلى بعض الخلايا المناعية == Effect of Klebocin partialy purified from bacteria Klebsiella pneumoniae Local Isolated on some enteric bacteria &on some immune cells
Author name:
علي رزاق لفتة
Supervisor name:
رجوة حسن عيسى الربيعي | عصام فاضل علوان الجميلي
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3385 - p.pdf
Abstract:
تضمنت الدراسة جمع 210 عينة سريرية توزعت الى 60 عينة ادرار و50 عينة قشع و50 عينة من التهابات الاذن الوسطى و50 عينة من اصابات الجروح ومن خلال نتائج الزرع البكتريولوجي على اوساط الماكونكي واكار الدم ووسط Eosin Methylen Blue , والتشخيص المظهري والكيموحيوي وتاكيد التشخيص باستخدام نظام Api20 تم الحصول على 42 عزلة تعود لبكتريا Klebsiella توزعت الى 23 عزلة بنسبة 54.76% تعود للنوع K.pneumoniae و11 عزلة وبنسبة 26.19% للنوع K.oxytica و8 عزلات وبنسبة 19.05% تعود للنوع K.planticola ، لقد تم التحري عن العزلات المنتجة للكليبوسين ومن خلال تم التوصل الى ان 8 عزلات فقط كانت منتجة للكليبوسين من اصل 23 عزلة هذا وبنسبة 34.78% ، وكان وسط Tryptic soy broth المضاف اليه خلاصة الخميرة بنسبة1% افضل وسط لانتاج الكليبوسين وتعد طريقة اقراص الاكار ملائمة للتحري عن العزلات المنتجة للكيبوسين وطريقة التخطيط المتقاطع كفوءة للتحري عن العزلات الدالة . اختيرت العزلة المنتجة K. pneumoniae 8 كافضل عزلة منتجة للكليبوسين والعزلة K. pneumoniae 2 كافصل عزلة دالة ، تلاها استخلاص الكليبوسين من العزلة المنتجة بعد ان تم حث العزلة بالمايتوماسين سي فكانت فعالية 80 وحدة/مليلتر والفعالية النوعية 800 وحده/مليغرام بروتين . نقـي الكليبوسين المنتج من العزلة المنتخبة بخطوات عدة تضمنت التركيز باستخدام كبريتات الامونيوم بنسب اشباع 70% وكحول البيوتانول بنسبة 1 : 1 فكان الترسيب بالبيوتانول افضل من الكبريتات الامونيوم اذ بلغت الفعالية 640 وحدة/مليلتر وبفعالية نوعية 2560 وحدة/مليغرام بروتين ثـم تقنيتي كروموتوغرافيا التبادل الايوني باستعمال المبادل DEAE - Cellulosو الترشيح الهلامي علـى عمـود السيفاكريلS - 200 . وكانت عدد مرات التنقية للكليبوسين بمقدار 10 والحصيلة للكليبوسين المنقى 6%.تم دراسة تاثير الكليبوسين المنقى على بعض انواع البكتريا المعوية المقاومة للمضادات الحياتية والتي شملت : Enterobacter sakazaki Shigella flexneri, E.coli, Citrobacter koseri, , Enterobacter cloacae K.oxytoca, Proteus mirabilis Serratia marcescens, , Enterococcus fecalis Salmonella typhi واظهرت النتائج ان Enterococcus fecalis وCitrobacter koseri, وProteus mirabilis كانت مقاومة لتاثير الكليبوسين المنقى في حين بقية الانواع تاثرت وكان تركيز 100مايكروغرام/مليلتر اكثرفعالية من بقية التراكيز حيث بلغ قطرالتثبيط 20ملم تجاه النوع K.oxytoca تلاها E.coli بقطر 17ملم ثم Shigella flexneri بقطر 15ملم ثم Enterobacter sakazaki بقطر 15 ثم Salmonella typhi بقطر 14 ملم ثم Enterobacter cloacae بقطر 12ملم ثم Serratia marcescens بقطر 12ملم . استعملت تراكيز التالية 10 ، 30 ، 50 مايكروغرام/مليلتر في دراسة التاثير السمي للكليبوسين على بعض الخلايا المناعية من خلال ملاحظة عيوشية تلك الخلايا وقد تم توصل الى عدم وجود تاثير للكليبوسين بتركيز 10 مايكروغرام/مليلتر على شكل وحجم الخلايا PMNs وقدرتها على بلعمة خميرة الكانديدا المقتولة اذ اظهر التحليل الاحصائي عدم وجود فروق معنوية (0.05< P) مقارنة مع معامل السيطرة . بينما حفز التركيز نفسه قدرة PMNs على قتل الخميرة الحية في الزجاج ، مما يدل على ان الكليبوسين المنقى من K. pneumoniae 8 يعمل على تحفيز الاستجابة المناعية الخلطية والخلوية . اما التراكيز العالية للكليبوسين المنقى من العزلة المحلية K. pneumoniae 8 فانها سببت تثبيطا ملحوظا لفعاليات الخلايا PMNs واللمفاوية التي اختيرت في هذه الدراسة. | The study has included collecting (210) clinical samples distributed into (60) urine samples, (50) sputum samples, (50) otitis media samples, and (50) wounds infections samples. Through results obtained from bacteriological culture on McConkey, blood, and eosin methylene blue agars in addition to morphological and biochemical identification and confirmation of the identification by using of API 20E system. Fourty tow Klebsiella isolates distributed into (23) K. pneumonia isolates that represent (54.76%), (11) K. oxytoca isolates that represent (26.19%), and (8) K. planticola isolates that represent (19.05%). Then, the klebocin - producing isolates have been detected and through which it is clear that only (8) isolates produce klebocin in (23) isolates, of percentage (34.78%). Tryptica soy broth medium with yeast extract additive in percentage of (1%) was the best medium for production of klebocin, agar discs method was the best method for klebocin - producing isolates detection, and cross - streaking method was the best method for indicating isolates detection. The producing isolate, K. pneumonia 8, and the indicating isolate, K. pneumonia 2, were chosen as the best producing and indicating isolates respectively. Next, the klebocin has extracted from the producing isolate after isolate induction by Mitomycin C; consequently, the activity was (80) unit/ml and the specific activity was (800) unit/mg of protein. The produced klebocin has been purified from selected isolates via several methods including precipitation utilizing ammonium sulfate in saturation percentage of (70%) and butanol alcohol; as a result, the butanol precipitation was better than that in ammonium sulfate so that the activity reached (640) unit/ml with specific activity of (2560) unit/mg of protein. Then, the second method was purification by ion exchange chromatography using exchanger (DEAE - Cellulose) and the third one was gel filtration over sefacryl S - 200 column. The times of purification of klebocin were (10) and the gain of purified klebocin was (6%). The purified klebocin effect has been studied on group of enterobacteria resisting for antibiotics including Acinetobacter, Escherichia coli, Shigella flexneri, Enterobacter sakazaki, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Citrobacter koseri, Salmonella typhi, Enterococcus faecalis, and Serratia marcescens. The results show that Enterococcus faecalis, Citrobacter koseri and Poteus mirabilis were resistant to the effect of the purified klebocin; however, all the remaining isolates affected. The concentration of (100) µg/ml has more activity than the remaining concentrations so that the inhibition diameter reached (20) mm in the species K. oxytoca, followed by E. coli with diameter of (17) mm, then Shigella flexneri with diameter (15) mm, then Enterobacter sakazaki with diameter (15) mm, followed by Salmonella typhi with diameter (14) mm, then Enterobacter cloacae with diameter (12) mm, followed by Serratia marcescens with diameter (12) mm. Of concentrations of (10, 30, 50) µg/ml, the toxic effect of klebocin on immune cells has been studied through viability of these cells; the study achieved that the klebocin in concentration of (10) µg/ml did not affect on the shape and size of phagocytic cells and its ability of phagocytosis of killed Candida yeast; so that, statistical analysis showed that there is no significant differences (P>0.05) comparing with control factor. However, the same concentration stimulate the macrophages ability of killing living yeast in vivo, which indicate that the purified klebocin from K. pneumonia 8 works on stimulating humeral and cellular immune response. Nevertheless, the high concentrations of purified klebocin from the local isolate, K. pneumonia 8, caused noticed inhibition to activities of macrophages and lymphocytes selected in this study.
