Share
تاثير التطفير الفيزيائي على قابلية بكتريا Staphylococcus aureus في انتاج انزيم الستافلوكاينيز واستنساله في بكتريا Escherichia coli == Effect of physical mutagenesis on the ability of Staphylococcus aureus in staphylokinase production and its cloning in Escherichia coli
Author name:
علاء سالم حمزة
Supervisor name:
رياض عبد الحسين دلول | حميد مجيد جاسم
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3365 - p.pdf
Abstract:
هدفت الدراسة الى استنسال جين الستافلوكاينيز من بكتريا Staphylococcus aureus المعزولة محليا في بكتريا Escherichia coli والتحري عن التعبير الجيني في المضيف الجديد فضلا عن دراسة بعض الظروف المثلى المؤثرة في ذلك التعبير . جمعت 200 عينة سريرية من اصابات المجاري البولية والاصابات الجلدية من بعض المستشفيات في محافظة بغداد . وقد تم الحصول من تلك العينات على 54 عزلة بكتيرية وشخصت على انها S.aureus وفقا لخصائصها المظهرية ونتائج الاختبارات الكيموحيوية . وقد تم تاكيد تشخيص تلك العزلات باستخدام نظام Viteck - 2 التشخيصي . تم دراسة قابلية عزلات بكتريا S.aureus في انتاج انزيم الستافلوكاينيز وفعاليته التحليلية على وسط بلازما الدم المتصلب بمادة الاكار . وقد اشارت النتائج الى ان جميع العزلات البكتيرية كانت منتجة وبدرجات متفاوتة لانزيم الستافلوكاينيز . وقد تميزت العزلة البكتيرية S.aureus A15 المعزولة من اصابات الجلد بكفائتها العالية في انتاج الانزيم لكون رائق مزرعتها ادى الى تكوين اعلى قطر هالة تحلل مقداره 36 ملم على وسط بلازما الدم المتصلب بمادة الاكار . ولاجل تحسين قابلية العزلةA15 S.aureus في انتاج انزيم الستافلوكاينيز ، فقد تم تعريض هذه العزلة للتطفير العشوائي باستخدام الاشعة فوق البنفسجية لحث الطفرات الوراثية التي تحور ايجابيا انتاجيتها من انزيم الستافلوكاينيز . وقد اشارت النتائج الى انه قد تم الحصول على طافرتين بكتيريتين لهذه العزلة ازدادت قابليتهما على انتاج الانزيم على ضوء زيادة قطر منطقة التحلل الى 38 ملم مقارنة بالنوع البري . اجري استنسال جين الستافلوكاينيز في بكتريا E.coli JM 109(DE3) وذلك باستخلاص الدنا الجيني اولا من الطافرة S.aureus A15 - M1 بطريقة الغليان ثم الحصول على الدنا بتركيز 50 مايكروغرام / مل وبنقاوة وصلت الى 1,8 . تم بعدها تضخيم جين الستافلوكاينيز باستخدام بادئات نيوكليوتيدية متخصصة لتضخيم اطار القراءة المفتوح (Open reading frame) للجين التركيبي . وقد اشارت نتائج التضخيم الى انه قد تم الحصول على قطعة دنا بحجم 400 زوج قاعدي . تم تحديد التعاقب النيوكليوتيدي لجين الستافلوكاينيز وقد اشارت النتائج الى وجود ثلاث طفرات نقطية (Point mutations) في الجين التركيبي للستافلوكاينز على اساس مقارنة الترتيب النيوكليوتيدي للجين مع الترتيب النيوكليوتيدي لنفس الجين للسلالة القياسية S.aureus المسجلة في قاعدة البيانات BLAST/ NCBI . وقد كانت هذه الطفرات من نوع missens mutations التي لم تؤثر على المجموعة التي ينتمي اليها الحامض الاميني المتغير ولم تؤثر على فعالية الانزيم . وقد اشارت النتائج ايضا الى عدم احتواء التعاقب النيوكليوتيدي للجين على اي موضع حساس لانزيمي التقييد BamHI وXbaI والتي استخدمت فيما بعد لكلونة الجين بالهضم المزدوج بهذين الانزيمين للحصول على قطعة تقييد ذات نهايات لاصقة من نوع BamHI وXbaIالناشئة عن مواضع التقييد الحساسة لهذين الانزمين ضمن التعاقب النيوكليوتيدي للبادئات النبوكليوتيدية المتخصصة المصممة لهذا الغرض (البادىء النيوكليوتيدي الامامي المتضمن موقع تقييد لانزيم BamHI والبادىء النيوكليوتيدي الخلفي المتضمن موضع تقييد لانزيم XbaI) ، ثم لحم قطعة تقييد جين الستافلوكاينيز مع ناقل الكلونة pSP72 المهضوم مسبقا هضما مزدوجا بانزيمي التقييد BamHI وXbaI للحصول على جزيئة ناقل ذات نهايات لاصقة متوافقة مع النهايات اللاصقة لجين الستافلوكاينيز . وبعد اللحم تم اجراء عملية الترحيل الكهربائي للناقل الهجين (جزيئة الناقل الحاوية على جين الستافلوكاينيز) على هلام الاكاروز (1%) . وقد اشارت نتائج الترحيل الكهربائي الى ظهور حزمة دنا تمثل الناقل الهجين بحجم كلي مقداره 2900 زوج قاعدي . وفي الخطوة اللاحقة من تجربة الاستنسال فقد استخدم الناقل الهجين لتحول بكتريا E.coli JM109(DE3) المؤهلة كمضيف جديد امن للجينات الغريبة القادمة من مختلف الكائنات الحية . وقد تم انتقاء المتحولات المرغوبة لبكتريا E.coli الحاوية على الناقل الهجين على وسط البلازما المتصلب بمادة الاكار الحاوي على المضاد الحيوي الامبسيلين بتركيز 50 مايكروغرام/ مل كصفة انتقائية للوسط . وقد اشارت نتائج التحول الى الحصول على خمسة متحولات بكتيرية من بكتريا E.coli JM109(DE3) القادرة على النمو بوجود الامبسيلين والمنتجة لانزيم الستافلوكاينيز المحلل لمادة البلازما في الوسط . وقد كانت درجة التعبير الجيني لجين الستافلوكاينيز في المضيف الجديد مقاربة لدرجة تعبير نفس الجين في المضيف الاصلي S.aureus . درست بعض الظروف المثلى لتعبير جين الستافلوكاينيز في بكتريا E.coli المهندسة وراثيا . وقد اشارت النتائج الى ان درجة التعبير الجيني في المضيف الجديد قد ازدادت بتنمية البكتريا في وسط لوريا - بيرتاني المتصلب بمادة الاكار الحاوي على مادة IPTG (كمحفز للتعبير الجيني) بتركيز 100 مايكروغرام / مل . كما درس تاثير درجة الحرارة على فعالية الانزيم واظهرت النتائج ان افضل درجة حرارة لفعالية الانزيم كانت °C 37 لمدة 24 ساعة . | This study was aimed for cloning staphylokinase gene from locally isolated Staphylococcus aureus in Escherichia coli and detection the gene expression in new host in addition to determine some of the optimum conditions for gene expression. A total of 200 clinical samples from urinary tract and skin infections were collected from some hospitals in Baghdad . from these samples,54 bacterial isolate were obtained and identified as S.aureus according to their cultural and morphological characteristics and results of biochemical tests . Identification of these isolates was confirmed by using VITECK - 2 identification system. Ability of S.aureus isolates in staphylokinase production and thrombolytic activity of this enzyme was screened on human plasma agar medium, and it was found that all bacterial isolates were able to produce staphylokinase with variable degrees. Among these isolates S.aureus A15 isolated from skin infection was the most efficient isolate in staphylokinase production because its culture filtrate causing highest zone of hydrolysis (36 mm) on plasma agar medium in comparison with other isolates. In order to enhance the ability of S.aureus A15 in staphylokinase production, this isolate was subjected to random mutagenesis by using UV - irradiation to induce genetic mutations altered positively staphylokinase production by this isolate. Results showed that two mutants of S.aureus A15 obtained after UV - irradiation were increased in its ability in staphylokinase production according to the increase of the diameters of hydrolysis zones to 37 mm and 38 mm in camparison with the wild - type. Cloning of staphylokinase (sak) gene in E.coli JM109 (DE3) was achieved first by extraction of S.aureus A15 - M1 genomic DNA by using boiling method with DNA purity and concentration of 1.8 and 50 μg / ml respectively . Then Sak gene was amplified by using specific primers for gene open reading frame (Structural gene) . Results showed that the amplification product was a fragment of DNA with size of about 400 bp. Amplified sak gene was then sequenced to determine the nucleotide sequence of the gene . Results of sequencing showed that there are three point mutation were occurred in the structural gene of staphylokinase according to base pair alignment with the same gene of S.aureus standard strain recorded in BLAST / NCBI. These mutations are missens mutations doesn’t affect the group of amino acid that was changed then doesn’t affect enzyme activity. Results of sequencing also showed that the complete nucleotide sequence of the gene doesn’t have a restriction site for BamHI and XbaI that were used later for gene cloning by double digestion of the gene with these two enzymes to obtain restriction fragment with sticky ends of BamHI and XbaI that were came from the restriction sites for these two enzymes within the specific primers designed for this purpose (forward primer containing restriction site for BamHI and reverse primer containing restriction site for XbaI). Then the restriction fragment of staphylokinase gene was ligated with pSP72 cloning vector previously double digested with BamHI and XbaI to get vector molecule with sticky ends compatible with the two sticky ends of Sak gene, then recombinant vector was analyzed on agarose gel (1%) . Results of electrophoresis showed that there was a single DNA band represents the recombinant vector with a total size of 2900bp. In the next step of cloning experiment , recombinant pSP72 was used to transform competent E.coli JM 109 (DE3) as a new and safe host for foreign genes came from different organisms . Then positive transformants of E.coli (containing recombinant pSP72) was selected on plasma agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin as a selectable marker. Results of transformation showed that there are five transformants of E.coli JM 109 (DE3) were able to grow in presence of ampicillin and producing staphylokinase enzyme that was able to hydrolyse human plasma in the agar medium . The degree of staphylokinase gene expression in the new host (E.coli) was asymbtotic to the degree of expression of the same gene in the original host (S.aureus) . Optimum conditions for staphylokinase gene expression in genetically engineered E.coli was studied under two growth factors . Results of optimization showed that the degree of gene expression in new host was increased when transformant E.coli JM 109 (DE3) was grown in Luria - Bertani agar containing IPTG (as inducer for gene expression) in a concentration of 100 μg / ml and incubated at 37 ⁰C for 24 hours . Effect of incubation temperature on staphylokinase activity produced by genetically engineered E.coli JM 109 (DE3) transformant was studied in range of temperature. Results showed that the optimum temperature for staphylokinase activity was 37 °C , at this temperature the diameter of zone of hydrolysis was 30mm , while the enzyme activity was decreased above and under this temperature .
