Share
التنميط والتحليل الجزيئي للمكورات العنقودية الذهبية المعزولة من نماذج سريرية == Molecular Analysis and Typing of Staphylococcus aureus isolated from clinical samples
Author name:
سوسن محمد كريم
Supervisor name:
سوسن ساجد محمد علي الجبوري | منعم رضوان علي
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3341 - p.pdf
Abstract:
• جمعت خلال الدراسة اربعة وثمانون عزلة من بكتريا المكورات العنقودية من عدد من مستشفيات بغداد للفترة الواقعة ما بين تموز - تشرين الثاني عام (2013) موزعة ما بين (43) عزلة من الالتهابات الجلدية , (15) عزلة من التهاب المسالك البولية , (5) عزلات لكل من الدم والتهابات الاذن , (3)عزلات من التهابات الانف ،(2)عزلتين من التهاب العيون وعزلة واحدة من لكل من القشع والسائل المنوي و(9) عزلات اخذت من مواقع بيئية مختلفة للمستشفيات .• تم العزل الاولي لبكتريا المكورات العنقودية الاوساط الزرعية واعتمادا على الصفات المظهرية على الاوساط الزرعية والفحوصات الكيموحيوية فضلا عن التشخيص بنظام (API Staph system) لتكون المحصلة النهائية (74) عزلة تعود لبكتريا المكورات العنقودية الذهبية .• تم التحري عن المكورات العنقودية المقاومه للمثيسلين بعدة طرق منها الطرق المظهرية وباستخدام طريقة الانتشار بالاكار حيث اظهرت النتائج ان هنالك 55 (74.32%)عزلة من المكورات العنقودية الذهبية مقاومة للمثيسلين في حين بلغ عدد العزلات الحساسة 8(10.82%) وقد لوحظ وجود عدد من العزلات التي ابدت مقاومة متوسطة للمثيسيلين 11 (14.86%) كما واستخدمت طريقتين مختلفتين من الطرق الوراثية للتحري عن مقاومه البكتريا للمثيسيلين . وذلك عن طريق التحري عن المورثات المحفوظة تطوريا (femA) المورث المسؤول عن تاكيد تشخيص النوع اضافة الى التحري عن المورث (mecA) المسؤول عن صفة مقاومة البكتريا للمثسيلين وباستخدام تقنية التفاعل التسلسلي المتضاعف (Polymerase Chain Reaction). قد اعتمدت طريقتان لتحضير دنا القالب، طريقة الغليان وقد اظهرت احتواء74 (100%)عزلة من المكورات العنقودية الذهبية في حين احتوت61 / 74عزلة على المورث (mecA) وبالاعتماد على وجود مورث صفة المقاومة للمثيسلين قد بلغت نسبة المكورات العنقودية الذهبية المقاومه للمثسيلين (82.43%) ، كما وبلغ عدد عزلات المكورات العنقودية الحساسة للمثيسلين التي لم تحتوي على مورث (mecA) 13/ 74 (17.57%) . ومن جهة اخرى استخدمت الطريقة المباشرة في تحضير دنا القالب واظهرت النتائج امتلاك فقط 17(22.97%) عزلة على مورث (femA) كما اظهرت 57/74 (77.03%)عدم امتلاكها على المورث، في حين ابدت (7) من العزلات التي ابدت اجابيتها لمورث (femA) امتلاكها على مورث (mecA) ولذلك فان نسبة بكتريا المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسلين بلغت (41.17%) في حين المكورات الحساسة للمثيسلين قد بلغت (58.83%). وقد اثبتت طريقة تحضير دنا القالب بالغليان بانها كانت اكثر كفاءة ودقة في الكشف عن المورثات من الطرق الاخرى .• تم استخدام طريقة الانتشارالثنائي في الاكار للكشف عن صفة المظهرية لمقاومة البكتريا تجاه مجموعة الماكروليدات، اللنكوز امايد والستربتوكرامين B وقد اظهرت النتائج (18/74) عزلة تمتلك صفة مقاومة دائمية للارثرومايسين (24.32%) توزعت بين (13/61) عزلة من عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومه للمثيسلين (21.13%) و(5/13) عزلة من عزلات المكورات العنقودية الذهبية الحساسة للمثيسلين (38.46%) ، كما واظهرت النتائج وجود (4/74) عزلة تمتلك صفة المقاومة المستحثة للاريثرومايسين(6.55%) وكانت كل العزلات مقاومة للمثيسلين واخيرا (29/74) عزلة من العزلات المقاومة والحساسة للمثيسلين ابدت مقاومة متوسطة للاريثرومايسين .• اظهرت النتائج سيادة صفة المقاومة الدائمية للاريثرومايسن بين عزلات المكورات العنقودية الذهبية الحساسة للمثيسلين بالمقارنة مع العزلات المقاومة للمثيسيلين وكذلك لوحظ وجود صفة المقاومة المستحثة للاريثرومايسن بين عزلات البكتريا السريرية المعزولة من الادرار والدم والافرازات العامة.• استخدمت تقنية PCR للكشف عن وجود مورثات مقاومة الاريثرومايسين (erm A, erm B and erm C) وقد اظهرت النتائج تغلب مورث erm A (7.35%) ووجوده في (5/68) عزلة من عزلات المكورات العنقودية الذهبية والتي تمتلك مختلف اشكال الصفات المظهرية لمقاومة المثيسلين وجميع العزلات كانت مقاومة للمثيسلين. في حين تواجد مورث erm C في (4/68) ونسبة (5.88%) اثنان منها كانت عزلة من الدم والقشع وقد كانتا موجبة في فحص التحري عن مقاومة الاريثرومايسين ، كما واظهرت نتائج فحص PCR عدم امتلاك العزلات على مورث erm B . ايضا كشفت النتائج عن سيادة المورثات erm A وerm C في التشفير لصفة المقاومة المستحثة للاريثرومايسين وانه لا دور يذكر لمورث erm B في مقاومة الاريثرومايسين.• تم التحري بتقنية PCR عن انتشار ووبائية مورث pvl بين عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسيلين وقد اظهرت النتائج وجوده في(4/61) ونسبة (6.55%) .• تم استخدام طريقة الانتشار بالاكار للتحري عن حساسية البكتريا اتجاه المضادات الحيوية وقد اظهرت النتائج مقاومة العزلات بشكل كامل (100%) لكل من الكلوكساسيلين والاوكساسيلين والسيفيبيم ،ومقاومة عالية اتجاه كل من امبسلين/ كلافيلونك اسد (98.36%) والسيفتازديم (95.2%) . وكانت هنالك مقاومة متوسطة اتجاه التتراسايكلين (31.14%) ومقاومة قليلة اتجاه كل من الازيثرومايسين (24.6%) والفانكومايسين (16.4%) والجنتامايسين (13.11%) والسبروفلوكساسين (13.11%) واقل مقاومة اتجاة الامبنم (6.55%). • استخدمت طريقة UPGMA المتوسط الحسابي Unweighted Pair - Group Method using arithmetic Average لبناء شجرة تطور السللالات Phylogenetic treeوتحديد العلاقة التطورية dendroram واعتمد model Tamura - Nei لقياس المسافة الوراثية بين انواع المكورات العنقودية للتعبير عن مدى تطور تلك المورثات. اظهرت النتائج للتحليل الشجيري وجود 151 عقدة و76 عقدة طرفية . مما يعكس وجود تنوع عالي في نمط المقاومه لفحص الحساسية للمضادات الحيوية بين العزلات المدروسة, وكذلك تنوع واضح وعالي بين عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة والحساسة للمثيسلين .مما يعكس الطبيعه التطورية لتلك العزلات. • تم اخضاع كل عزلات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثيسلين والحساسة للكشف عن مورث spa بواسطة استعمال بواديء متخصصة لتضخيم المنطقة المتغايرة من المورث وبحجم القطعة المكثره (300bp) وقد اظهرت النتائج (47/74) موجبة لمورث spa حيث كانت المكورات المقاومة للمثيسلين (67.2%) في حين كانت المكورات الحساسة للمثيسلين (46.15%) .• تم اختيار (25) نموذج من نواتج PCR لمورث spa تعود لعزلات ذات مصادر عزل مختلفة وتم ارسالها لغرض تحديد تتابع القواعد النايتروجينية، تم تسجيل كل البيانات التي تم الحصول عليها من تحديد تتابع القواعد النايتروجينه في بنك المورثات العالمي (المركز الوطني لمعلومات التكنلوجيا الحيوية National center for Biotechnology Information ) وكذلك في بنك اليابان ( DNA Data Bank of Japan) وبنك المورثات الاوربي التي تبدا بالتسلسل LC038119 وتنتهي بالتسلسل LC038142 .• اظهرت النتائج ان القطع المكثرة للمناطق المتغايرة كانت مختلفة في الاحجام وتراوحت اطوالها (65 - 335bp) من اصل الجين كذلك اجري تطابق تتابع القواعد النايتروجينة وترجمة البروتين وتحديد العلاقة التطورية وشجيرات تطور السلالات باستعمال (UPGMA) وبرنامج geneious software وقد اظهرت النتائج وجود نوعين من الشجيرات واحدة للتتابعات القصيرة (65 - 190bp) وواحدة للتتابعات الطويلة (190 - 335bp) • تم هظم المورث spa بواسطة انزيمين من الانزيمات القاطعة HinfI وHindIII واظهرت النتائج تنوعا ملحوظا في الطراز الوراثي بين العزلات . | • Eighty four isolates of Staphylococcus spp. were collected from different hospitals in Baghdad province, during the period July 2013 to November 2013, distributed as : 43 isolates from skin infection ; 15 isolates from UTI; 5 isolates from each blood and ear infection; 3 from nasal swab ; two isolate from eye infection ; while one isolate obtained from each sputum and seminal fluid and 9 isolates were taken from various hospitals environments and sites.• For preliminary isolation of Staphylococcus spp. was used culture media, and depending on features on cultures, Biochemical tests and (API Staph system).The final results were (74) isolates belonged to Staphylococcus aureus.• different methods for screening to methicillin resistance S. aureus, it were used phenotypic method (disc diffusion method), the results showed 55(74.32%) MRSA isolates, 8(10.82%) MSSA and 11(14.86%) intermediate resistance to cefoxitin. While in genotypic methods were used PCR technique to detection housekeeping gene (femA) responsible to confirm species and mobile genetic element (mecA) to confirm resistance of isolates to methicillin, PCR technique was done by used two different methods to prepare template DNA.• the results of PCR technique with used template DNA prepared by boiling method have been revealed all S. aureus isolates 74(100%) contained femA gene (100%) while 61/74(82.43%) isolates contained mecA gene (MRSA) and 13/74(17.57%) isolates devoid mecA gene MSSA. On the other hands, The results of PCR technique with used template DNA prepared by direct colony have been revealed only 17(22.97%) isolates contained femA gene and 57(77.03%) isolates was devoid femA gene (77.03%), the positive isolates to femA gene have been revealed contained 7(41.17%) mecA gene while 10(58.83%) isolates devoid mecA gene. So used PCR techniques with template DNA prepared by boiling method was appeared the effective method for screening about MRSA and detection mecA gene reflected on standard methods to confirm S. aureus to be MRSA.• Double diffusion disc was used method to screening about MLSB phenotype and the results showed 18/74(24.32%) S. aureus isolates had constitutive resistance to erythromycin cMLSB phenotype (which is distributed to13/61(21.31%) MRSA and 3/13(38.46%)MSSA, 6/74(9.83%) S. aureus isolates sensitive to erythromycin, all of them was MRSA, 4/74(6.55%) S. aureus isolates had inducible resistance to erythromycin D - shape also all of them was MRSA, 9/74(14.75) S. aureus isolates showed MS phenotype was resistance to erythromycin and sensitive to clindamycin without D - shape and finally 29/74) S. aureus isolates showed intermediate resistance to erythromycin distributed between MRSA and MSSA.• Results showed a higher prevalence of the cMLSB phenotype in the MSSA isolates compared with MRSA isolates, also was observed iMLSB phenotype among clinical samples of S. aureus specially MRSA isolates more frequently in urine, blood and general secretions.• PCR technique was used for screening about ermA, ermB and ermC genes and the results were showed the percentage of ermA gene in S. aureus isolates 5/65(7.35%) with different phenotypic resistance forms to erythromycin all five isolates is MRSA while ermC gene percentage was 4/68(5.88%) S. aureus isolates, two of them showed cMLSB phenotype and harboring with ermA gene and others two isolates recovered from blood and sputum showed inducible MLSB with D - shape phenomenon, none of the S.aureus isolates harboring with ermB gene. The results were also revealed that ermA and ermC predominant erm genes found in S. aureus and the ermC gene the prevalence gene in inducible Macrolides resistant MRSA and no role was found to ermB gene in Macrolides resistant MRSA.• PCR technique was used for screening about prevalence of pvl gene among S. aureus isolates and the results showed 4/61(6.55%) harboring with pvl gene.• Disc diffusion method was used to screening about antibiotics sensitivity and the results showed completely resistance (100%) toward cloxacillin, oxacillin and cefepime while some isolates showed high resistance toward Amoxicillin /Clavulinic acid (98.36%) and Ceftazidime (95.2%). the moderate resistance toward tetracycline (31.14%), the low resistance toward azithromycin (24.6%), vancomycin (16.4%), gentamycin (13.11%), ciprofloxacin (13.11%) and the lowest resistance appeared toward imipenem (6.55%).• unweighted pair group method (UPGMA) was used to build phylogenetic tree and to find dendrogram analysis , Adoption of the Model Tamura - Nei, to measure the genetic distance between the types of Staphylococcus aureus to express the evolution of these genes, the results were showed dendogram and phylogenetic tree have (151) node and (76) tips. also reflected highly diversity resistance antibiogram among isolates and high diversity between MRSA and MSSA isolates still found some similarities in antibiogram pattern. Reflecting the evolutionary nature of these isolates.• all MRSA and MSSA isolates were subjected to screening about spa gene by used specific primers for variable region with PCR product size (300bp), and the results showed (47/74) isolates with positive results and (27/74) with negative results, (67.2%)MRSA isolates showed positive results while(46.15%)MSSA isolates showed positive to spa gene.• the 25 samples of PCR products from spa gene related to different sources of isolation were send for sequencing, then all data obtained from genes sequencing were submitted to gene bank national center for biotechnology information (NCBI), DNA data bank of Japan (DDBJ) and European Bioinformatics Institute (EMBI) under accession number started with (LC038119) and ended with (LC038142). ,The results showed the size of amplified fragments were variable and ranged from (65 - 335bp) in the original gene also pairwise sequence alignment to spa gene fragment, protein translation, Dendogram and phylogenetic tree were built by using (UPGMA) and genetic distance model Tamura - Nei with cost matrix identity (1.0 - 0.0) with geneious software, the results were showed two dendogram and phylogenetic tree first for short sequence (65 - 190bp) have 17 node and 9 tips while second for long sequence (190 - 335bp) have 31 node and 16 tips.• PCR - RFLP for spa gene was done by using two restriction enzyme HindIII and HinfI and the results showed high diversity among MRSA isolates
