استخلاص وتنقية جزئية للكتينات بكتريا Pseudomonas aeruginosa المعزولة من حالات مرضية
Author name:
زينب نوري حامد محمد العاني
Supervisor name:
عبد الواحد باقر الشيباني | خليل مصطفى خماس
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3317 - p.pdf
Abstract:
تم جمع (50) مسحة تعود لمرضى ومراجعين لثلاث مستشفيات عامة في بغداد وذلك للتحري عن عزلات الـ Pseudomonas aeruginosa اخذت من حالات مرضية متعددة شملت الحروق والجروح والتهابات الاذن. وبعد ان اجريت على العزلات التي تم الحصول عليها الاختبارات الكيموحيوية اللازمة لتشخيصها ومنها القابلية على تحليل الدم على وسط الـ Blood agar ، امكن انتقاء (25) عزلة اظهرت قدرتها على انتاج انزيم الـ hemolysinase وتحليل وسط الدم بشكل كامل. اخضعت العزلات بعدها لاختبار القابلية على النمو على وسط السترمايد الانتقائي والقدرة على النمو في 42 م ، اذ انتخبت (18) عزلة منها. ثم تبع ذلك اختبار قابلية العزلات على انتاج اللكتينات من خلال عملية التلازن مع كريات الدم الحمر للانسان بفصائلها (O, B, A) ودم بعض الحيوانات _الماعز ، الدجاج ، الفئران والارانب) حيث تم انتقاء العزلات التي اعطت اعلى عيارية. زرعت العزلات على وسطي الانتاج (GE) Grelets mediumوالمرق المغذي (Nutrient broth) للتحري عن قابليتها على انتاج اللكتينات، ودلت النتائج على انتاجها لنوعين من اللكتينات هما PA - I والـ PA - II ، اذ يتميز الاول بتخصصه تجاه سكر الكالكتوز، فيما يتخصص الثاني بالمانوز. بعد انتهاء فترة التنمية تم استخلاص اللكتينات من اوساط الانتاج لتجري عليها عملية التنقية باستخدام كبريتات الامونيوم ثم التكسير بالموجات فوق الصوتية ، ليتم بعدها انزال الراشح باستخدام طريقة الفصل بكرموتوغرافي عمود الفصل يمكن تلخيص اهم النتائج التي تم الحصول عليها بالاتي : 1 - اظهرت مستخلصات اللكتينات تباينا في الفاعلية التلازنية تجاه كريات الدم الحمر للانسان والحيوان سواء اكانت معاملة بانزيم التربسين ام لم تعامل به، كما تباينت العزلات في انتاجها لانزيم الهيمولايسين وصبغة البايوسين الزرقاء. 2 - تم تحديد درجة الحرارة المثلى لنمو عزلات بكتريا الـ aeruginosa P. وانتاجها للكتينات ب37م عندما بلغ تركيز اللكتين PA - I 95 مايكروغرام / سم3 ، في حين كان تركيزه عند الحرارة 35 م مايكروغرام/ سم3. اما اللكتين PA - II فبلغ تركيزه 40 مايكروغرام / سم3 عند الحرارة 35 م . 3 - وكان لاختلاف الاس الهيدروجيني دور في التاثير على تركيز ونقاوة اللكيتنات المستخلصة. اذ لم يتجاوز تركيز اللكتين PA - II المستخلص من العزلة (Z1) الـ30 مايكروغرام / سم3 عند الاس الهيدروجيني 5.0 في حين بلغ التركيز 105 مايكروغرام / سم3 لنفس اللكتين عند الاس الهيدروجيني الامثل (7.0) . اما اللكتينPA - I فقد انخفض تركيزه من 85 مايكروغرام/ سم3 في الاس الهيدروجيني الامثل ليصل الى35 مايكروغرام / سم3 عند الاس الهيدروجيني 8.0. 4 - تمت تنقية اللكتينات المستخلصة بطريقة الترحيل الكهربائي في هلام متعدد الاكريلامايد بظروف ماسخة ، من خلال تمرير اربعة نماذج مستخلصة (اضافة الى نموذج البروتينات القياسي). 5 - لدى اختبار حساسية العزلات المعزولة من التهابات الاذن لمضادات الحياة ، اظهرت تباين في مقاومتها للمضادات، وكانت جميع العزلات مقاومة لكل من الامبسلين والاموكسيسيلين، فيما كانت حساسة للمضادات توبرومايسين والجنتامايسين والارثرومايسين. 6 - لاختبار قابلية اللكتينات المستخلصة على الارتباط بالسكريات الموجودة في حليب الام وحليب البقر والحليب المصنع، دلت النتائج بانه اضافة عالق الدم صنف O الى اللكتين مع سكريات الحليب تاركا كريات الدم الحمر حرة. 7 - اثبتت تجربة استخدام المرهم الطبي المضافة له بعض السكريات البسيطة كفاءتها، بعد ان تبين قدرة هذه السكريات على تثبيط تلازن اللكتينات مع كريات الدم الحمر للانسان خارج الجسم.8 - بعد ان حقنت فئران التجارب باللكتينات (PAI,PA - II,PAII) المستخلصة من العزلات (Z4,Z1,Z1) ، كان المحتوى الكاربوهيدراتي فيها (95،48، 30) مايكروغرام/سم3 وتركيز البروتينات (1350،860، 590) مايكروغرام / سم3 على التوالي. كما ولوحظ ظهور حالات غريبة على الفئران الثلاثة في المجموعة الاولى والتي حقنت باللكتينات اعلاه وتركت بدون علاج لمدة ساعة، ما بعد قتلها فقد حدث تحلل دم كامل في الفار الاول ومتوسط في الثاني، في حين لم يحدث اي تحلل للدم في الفار الثالث. وبعد استخدام العلاج في فئران المجموعة الثانية، لم يحدث تحلل دم للفار الاول والثالث وكان التحلل ضعيفا في الثاني. اما فئران المجموعة الثالثة والتي حقنت وتركت لمدة ساعتين بدون علاج، فقد نفق الفار الاول وحدث تحلل ضعيف في دم الفار الثاني وتحلل كامل في الفار الثالث. لم يسبب اعطاء العلاج لفئران المجموعة الرابعة وتركهم لمدة ساعتين اي تحلل لدم الفار الاول والثالث فيما كان ضعيفا في الثاني. اما افراد المجموعة الثانية فقدتركت بعد الحقن ثلاث ساعات بدون علاج، وكان تحلل الدم كاملا في الفار الاول ومتوسطا في الثاني والثالث، في حين لم يحدث تحلل للدم بعد اخذ العلاج. | Fifty samples were collected from several pathogenic cases including burns, wounds and ears belonging to patients and individuals referred to three general hospitals in Baghdad. Samples were subjected to the microbiological tests for detecting Pseudomonas aeruginosa, isolales. Among those tests was the ability of blood analysis on blood agar base medium. A total of (25) isolates were selected which showed the ability to produce the hemololysins. Some suspected isolates were also subjected to grow on ctramide agar, and with stand growth at 42c. Out of (25) only (18) isolate selected due to their ability to grow at 42c. The (18) selected isolates were tested for their ability to produce lectins via the heamagglutination with the human red blood cell groups (A, B, O). Isolates showed higher titers were chosen, when ability to produce lectins, two types (PA - I and PA - II) lectins were detected. Lectin PA - ICharacterized by it’s specify toward galactose, while PA - II was specific to mannose. After lectins were extracted from the production media, they were purfeyed by using ammonium sulphate and fractioned by the ultrasonic waves, followed by descending the filtrate by separation, through the chromatographic column.Results obtained could be described briefly as : 1. Obtained lectins showed were differed in their haemagglutination activity toweras human and animals red blood cells whether they were treated by the trypsin enzyme or not. However, isolates were not similar in producing the hemolysin enzyme and pyocine pigment.2. Optimum temperature for growth of P. aeruginosa isolate, and lectins production was 37c when concentration of lectin PA - I reached 95.0 µg/ml, while at 35c was 35 µg/ml - Regarding PA - II reached 40 µg/ml at 35c.3. Variation of pH played a significant effect on the. concentration and purity of the extracted lectins. At pH5.0 lectin PA - II concentration did in exceed 30, µg/ml while at optimum pH (7.0) it reached 105 µg/ml in the optimum pH to only 35 µg/ml at pH 8.0.4. Extracted lectins purified by gel electrophoresis when four extract in addition to the standard proteins sample were passed through it. The molecular weight of the PA - I was lectin from Z1 was 14.000 Dalton, while PA_II was 12.000 Dalton from the same sample.5. When P. aeruginosa isolates of ear infection were tested for their susceptibility to some antibiotics, they differed in their pattern of resistance. However, all isolates were resistant to Ampicilin and Amoxocilin, but sensitive to Tobramycin, Erythromycin and Gentamycin.6. In order to test the ability of the extracted lectin against some sugar which present in the human milk, raw milk and powder milk, red blood cell group were added to the lectin with the milk samples. Results showed that sugars inhibited haemagglutination with the red blood cells. 7. Experiments and application of the prepared ointment containing simple sugar proved its efficiency when sugar were able to prevent lectin agglutination with human red blood cells (invitro).8. After injecting mouse with the lectins (PAI, PAII, PAII) at (Z1, Z1, Z4) isolates, concentration of CHOs were (30, 48, 95) µg/ml and protein were (135, 860, 590) µg/ml respectively. Abnormal cases were also appeared on the three mice at the first group which was injected by the lectin when they were left without treatment for one hour, after they were killed, the first one was showed complete analysis at red blood cells, while it was not complete in the second and no analysis was showed in the third one, after treatment, no analysis of red blood cells was showed in the first and the third one, but it was not complete in the second one.The third group which injected by the same lectins when they were left without treatment for two hours the first mouse was dead, and the hemolysis was not completed in the second one, but completely in the third one, after treatment no hemolysis was showed in the first and the third one, but weakly in the second one. The fourth group, which injected by the lectins when they were left without treatment for three hours, the first mouse, was showed complete hemolysis, but not complete in the second and third one, after treatment, no hemolysis of red blood cells was showed.
