Abstract: يتميز التهاب الكبد الفايروسي بقابليته الوبائية على اصابة العديد من الافراد ويطلق مصطلح التهاب الكبد الفايروسي على عدد من الفايروسات المصيبة للكبد التي تم تسميتها حسب اكتشافها الى A,B,C,D,E,F,G ويعتبر التهاب الكبد الفايروسي C وBمشكلة كبيرة وذلك لعدم امكانية تشخيص الاصابة الفايروسية منذ البداية لكون اغلب الاصابات تكون بدون اعراض مرضية او باعراض خفيفة.المواد وطرائق العمل : شملت الدراسة الوبائية 1159عينة لمرضى الثلاسيميا الذين يراجعون مركز الثلاسيميا في الرصافة، والمجموعة الثانية 140915 عينة اخذت لمتبرعي الدم في المركز الوطني لنقل الدم اعتمدت من السجلات. وتم اجراء الفحوص الفايروسية (HCV,HBV,HIV) لهذه المجاميع، واجريت الفحوص الفايروسية التشخيصية الاخرى على مرضى الثلاسيميا، فضلا عن اجراء الفحوص المناعية، فحوص الدم، والفحوص الكيميوحيوية.النتائج : افرزت نتائج مرضى الثلاسيميا عن نسبة 24.76% (70عدد الذكور و110 عدد الاناث) موجبة لفحص anti - HCV، ونسبة 0.77% (7 من الذكور و2 من الاناث) موجبة لفحص HBsAg، وبنسبة 0.34% (2 من الذكور و2 من الاناث) موجبة لكلا الفحصين (علما ان جميع المرضى بدون علاج الانترفيرون) مقارنة مع متبرعي الدم بنسبة 0.4% لـanti - HCV و0.97% لـHBsAg،علما ان جميع نتائج فحص HIV كانت سالبة لمرضى الثلاسيميا ومتبرعي الدم، هذا بالنسبة للدراسة الوبائية. اظهرت الدراسة التحليلية المختبرية ان نسبة الاصابة بفايروس التهاب الكبد HCV اعلى في الذكور بنسبة 27.48% مقارنة مع الاناث بنسبة 21.35% بوجود فرق ذو دلالة احصائية معنوية لارتفاع نسبة الذكور عن الاناث، فيما لوحظ ان النسبة هي ذاتها 0.3% لذكور واناث مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV ولوحظ ارتفاع الاصابة مع ازدياد العمر فاعلى نسبة للاصابة بـ HCV 41.5% هي للاعمار ما بين 21 - 30سنة وللمصابين بـHBV بنسبة 1.7% للاعمار ما بين 1 - 11سنة. ولوحظ ارتفاع نسبة الاصابة بـ HCV بين الاكراد بنسبة 85.7%. اما بالنسبة الى HBV فقد لوحظ ان النسبة هي 5.7% بين الاكراد، اما في العرق العربي فقد لوحظت نسبة HCV 22.83%، وHBV 0.63% وفي الكلدان لوحظ ان نسبة الاصابة بـHCV 20%. اجري فحصPCR على بعض مرضى الثلاسيميا واظهرت الدراسة ان 50% من النتائج موجبة، وباجراء الكشف عن النوع الجيني لفايروس HCV بطريقة RFLP تم الحصول على انماط جينية مختلفة تضمنت 3b,4,6,3a,2b,1b واجريت دراسة مناعية على المرضى الموجبين لفحص PCR، وكشفت النتائج ان 18% من اولئك المرضى قد ابدوا تفاعلات موجبة لاضداد النواة واضداد العضلات الملساء في حين لم يظهر اي نتيجة موجبة لاضداد الدنا، اضداد الميتوكوندريا واضداد الشحوم المفسفرة. اجري الترحيل الكهربائي لبروتينات المصل وتبين وجود ارتفاع ذو دلالة احصائية معنوية لبروتين الكلوبيولين مقارنة بالالبومين، بارتفاع معدل بروتين كاما وانخفاض معدل بروتين الالبومين لمرضى الثلاسيميا الموجبين لفحص HCV - PCR.اجري على بعض مرضى الثلاسيميا فحوصات عمل الكبد ولوحظ ارتفاع معدل TSB في مرضى الثلاسيميا الموجبين لفحص anti - HCV,HBsAg فضلا عن ارتفاع معدل ALTفي المرضى الموجبين لفحص HBsAg عن المرضى الموجبين لفحص anti - HCV، كذلك لوحظ ارتفاع معدل AST لمرضى الثلاسيميا الموجبين لفحص anti - HCV,HBsAg فيما لوحظ ان معدل انزيم الفوسفاتيز القاعدي هو ضمن الحد الطبيعي لمرضى الثلاسيميا الموجبين لفحص anti - HCV,HBsAg، وتم اختيار مجموعة من مرضى الثلاسيميا الموجبين لفحص anti - HCV,HBsAg وغير المصابين بـ HCV,HBV واجريت عليهم عدد من الفحوص الكيميوحيوية لمستوى (البروتين الكلي، الالبومين، الكلوبيولين، اليوريا، الكرياتنين، حامض اليورك، البوتاسيوم، الفسفور غير العضوي، الكالسيوم، النحاس، الكلسترول والسكر) في الدم، ولم يلاحظ اي دلالة احصائية معنوية لهذه الاختبارات، عدا اختبار الكولسترول حيث لوحظ انخفاض معدل الكولسترول في مرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV الى 112.7mmol/L، وفي مرضى الثلاسيميا المصابين بـHBV بمعدل mmol\L93.69 كما لوحظ وجود انخفاض ذو دلالة احصائية معنوية بين مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HCV,HBV مقارنة مع غير المصابين بـHCV,HBV، كذلك لوحظ وجود دلالة احصائية معنوية لانخفاض معدل حامض اليورك لمرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV,HBV مقارنة مع مرضى الثلاسيميا غير المصابين، ووجد ارتفاع ذو دلالة احصائية معنوية لمستوى النحاس في الدم لمرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV وغير المصابين مقارنة مع المصابين بـHBV. ووجد ارتفاع ذو دلالة احصائية معنوية لمستوى السكر في الدم لمرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV مقارنة بمرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV وتبين وجود فرق معنوي لارتفاع معدل الفسفور غير العضوي لمرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV وغير المصابين بـHCV,HBV مقارنة بالمصابين بـHBV. اجريت الفحوص المناعية على مجموعة من مرضى الثلاسيميا الموجبين لفحص anti - HCV,HBsAg وغير المصابين وتضمنت الدراسة المناعية الكشف عن مستويات الكلوبيولينات المناعية في الدم ومكونات المتممة C3,C4فضلا عن الكشف عن اضداد الذات، ولوحظ ارتفاع نسب اضداد الذات لمرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV مقارنة مع غيرهم من مجاميعمرضى الثلاسيميا وتبين ارتفاع نسبة اضداد المايتوكوندريا (43.4%)، اضداد الهستون (40.9%)، اضداد العضلات الملساء (17%)، الاضداد النووية (17%)،اضداد شحم القلب (11.6%)، اضداد الشحوم المفسفرة (17%)، اضداد الدنا المزدوج الشريط (31.8%)، اضداد بروتينات النواة A - Jo - 1 (2.27%)، SS - B (4.5%)، A - Scl (3.4%) في حين ان اضداد الذات من نوع A - RNP/Sm,SS - A,A - Sm,AC - B لم يلاحظ اي نتيجة موجبة لها. اما في مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV فقد تم الحصول على نسبة (15.38%) لكل من اضداد الهستون، اضداد شحم القلب، اضداد الشحوم المفسفرة فيما كانت نسبة اضداد الميتوكوندريا (38.46%). كما لوحظ ارتفاع نسبة المصابين بالعامل الرثوي والبروتين الفعال في مرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV بنسبة 46%، 68% على التوالي مقارنة مع غير المصابين بـHCV,HBV وفي مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV بنسبة 38.4% لكل من RF,CRP. وتبين وجود فرق معنوي ذو دلالة احصائية لارتفاع الاصابة باضداد الذات ضد الهستون في الاناث مقارنة مع الذكور وارتفاع الذكور عن الاناث في اضداد المايتوكوندريا في مرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV. كذلك لوحظ ارتفاع بعض الكلوبيولينات المناعية في مرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV بمستوى 1789 mg/dl للـIgG، ولوحظ مستوى 305.8 mg/dl للـ IgA فيما كان المستوى 203.3 mg/dl للـIgM، وفي مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV لوحظ ارتفاع مستوى IgG الى mg/dl1823.6، اما مستوى IgM وIgA فقد كان بمستوى 229.6 mg/dl، 278.8mg/dl بالتعاقب، وفي بروتينات المتممة C3,C4 لوحظ انخفاض مستوى C3 الى 82.6mg/dl فيما كان مستوى C4 23.7mg/dl وهو ضمن الحد الطبيعي الادنى في مرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV، اما في مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV فقد لوحظ ان مستوى بروتينات المتممة C3 اقل من المستوى الطبيعي 78.1 mg/dl فيما كان المستوى 20.3mg/dl الى C4.في اختبارات امراض الدم تم الحصول على دلالة احصائية معنوية لارتفاع معدل PT لمرضى الثلاسيميا المصابين بـHCV مقارنة مع غير المصابين ومرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV، كما لوحظ انخفاض معدل تعداد كريات الدم العدلة لمرضى الثلاسيميا المصابين بـ HCV مقارنة مع مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV ومرضى الثلاسيميا غير المصابين. ولوحظ انخفاض معدل تعداد الصفائح الدموية لمرضى الثلاسيميا المصابين بـ HBV مقارنة مع مرضى الثلاسيميا المصابين بـ HCV ومرضى الثلاسيميا غير المصابين. | Viral Hepatitis characterized by its epidemic ability to infect many people. Viral hepatitis called to many hepatic viral infection that had been classified into A,B,C,D,E,F,G. Hepatitis C infection considered a big problem related to the inability to diagnose the viral infection from the beginning because of mild or no symptoms. Material & Methods : - The epidemic study contains two groups, first group 1159 sample of thalassemic patients in Al - Rusafa Center For Thalassemic Patients. Second group 140915 samples taken from blood donors in the national blood bank from the records.Viral tests had been done for these groups (HCV,HBV,HIV). Diagnostic tests done on thalassemic patients like immunological, hematological, biochemical tests.Results : - For the epidemic study the result shows a 24.76% for thalassemic patients infected with HCV , 0.77% for thalassemic patients infected with HBV, & 0.34% for thalassemic patients infected with both HCV,HBV. 74.89% for non infected thalassemic patients compared with blood donors of 0.4% for HCV infection, and 0.97% for HBV infection.Studies for investigating laboratory tests done on thalassemic patients after confirming HCV,HBV infections through doing diagnostic viral tests.HCV Viral results shows higher percentage of male to female by 27.48% for male, 21.35% for female respectively and it was seen that the same rate of 0.3% for male and female infected with HBV. Higher infection rate with age increasing of 41.5% for age group 21 - 30 years of HCV thalassemic patients, and 1.7% for age group 1 - 11 years for HBV thalassemic patients. Higher HCV infection rate noticed for Kurdish people 85.7% , Christians 20%, and in Al - Sabeaa 40%.while the percentage of HBV in Kurdish people 5.7%, and no one infected with HBV infection in Christian and Al - Sabeaa people. For Arabic patients the percentage of HCV infection is 22.83% and 0.63% for HBV infection.HCV - PCR Thalassemic patient results show that 50% of results are positive and 50% are negative (11 out of 22 patients), doing genotyping of HCV by RFLP test shows different subtypes of HCV (3b, 2b, 1b, 3a, 4, 6).Immunological study done on PCR positive patients’ shows antibodies percentage of 18% to ASMA, ANA and 0% for each of AMA, ADNA, APL. Electroforeces done for protein of these patients show significant statistical increasing values of protein globulin in comparison to albumin decreasing.For liver function tests, applied on thalassemic patients it had been noticed that there is a significant statistical increasing values in the thalassemic patients infected with HCV as compared to other thalassemic patients not infected with HCV. Increasing the level of ALT in HBV patients compression with HCV patients, increasing the level of AST of HBV, HCV thalassemic patients where the level of alkaline phosphates in the upper limit of normal value of HCV, HBV thalassemic patients.No significant statistical values where noticed for the biochemical tests applied on some thalassemic patients infected with HCV, HBV infection except cholesterol where it had been noticed a decrease of level 112.7 mmol/L in thalassemic patients infected with HCV. 93.69 mmol/L in HBV infection patients, a significant statistical decrease value between HBV , HCV thalassemic patients in comparison with non infected patients.There is a decrease level of uric acid for the thalassemic patients infected with HCV compared with non infected patients, significant increase of copper level in the blood of HCV thalassemic patients compared with HBV infected thalassemic patients and not infected thalassemic patients.Significant statistical value increment for the random blood sugar in HCV thalassemic patients compared with HBV infected thalassemic patients.Regarding immunological study, it had been noticed that there is an increasing in autoantibody with significant statistical value for thalassemic patients infected with HCV compared with other thalassemic groups. It had been seen that there is an increasing in the mitochondrial antibodies (AMA - M2) 43.4%, antihiston antibodies (AHA)40.9%, antismooth muscle antibodies (ASMA)17%, antinuclear antibodies (ANA)17%, anticardiolipin antibody antibodies (ACL)11.6%, antiphosphotidel serin antibodies (APL - S)17%, antidouble stranded DNA antibodies (A - ds - DNA) 31.8%, other antinuclear proteins like A - Jo1 2.27%, SS - B 4.5%, A - ScL 3.4%, where the other auto antibodies A - RNP/Sn, SS - A, A - Sm, anticentromer B antibodies (A - C - B) show zero percent for each one of them while in the HBV thalassemic patients a 15.38% was obtained for each APL - S , ACL & AHA.. A 38.46% for AMA - M2.There is an increase in rheumatoid factor (RF), CRP in thalassemic patients infected with HCV compared with non infected thalassemic patients with a ratio of 46%, 68% respectively. In HBV thalassemic patients 38.4% for each RF and CRP. Significant statistical difference for increasing incidence with auto antibodies in the females compared with males of autoantibodies type AHA, AMA - M2 in thalassemic patients infected with HCV noticed.We noticed an increasing in the immunoglobulines IgG 1789 mg/dl, 305.8mg/dl for IgA in thalassemic patients infected with HCV while IgM in the upper normal range 302.3 mg/dl, complimentary portions C3, C4 shows a decrease level in C3 82.6 mg/dl, and the level of C4 is 23.4mg/dl, which is regard as the lower normal limit. While in the HBV thalassemic patients we obtain a level 1515.3mg/dl for IgG, 204.8 mg/dl for IgM and for IgA 233.3mg/dl.In the hematological tests of thalassemic patients infected with HCV shows significant increment in the level of PT test was obtained as compared with other groups of thalassemic patients. Percentage decrement in neutrophil of WBC cells in HCV thalassemic patients as compared with HBV and non infected thalassemic patients. There is a decrement in platelets count in HBV thalassemic patients compared with HCV and non infected thalassemic patients.

استخلاص ، تنقية وتوصيف انزيم اللكنين بيروكسيديز المنتج من العزلة الفطرية المحلية Aspergillus terreus == Extraction, purification and characterization of lignin peroxidase enzyme produced from local fungal isolate Aspergillus terreus

Author name: سحر غازي عمران عبد الواحد التميمي

Supervisor name: ندى صباح رزوقي | غازي منعم عزيز

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Doctorate

University: University of Baghdad

Language: English

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تم عزل وتشخيص 18 عزلة فطرية محلية من 75 عينة روث خيول جمعت من نادي الجادرية ونادي العامرية للفروسية في بغداد خلال 8 اشهر للفترة من تموز 2013 الى اذار 2014 . سجلت العزلة A. niger اعلى نسبة ظهور بين العزلات واعلى تكرار % 80 %9.8, على التوالي تبعتها العزلة A.fumigatus (%9.8 , % 48) ثم العزلة A.terreus (% 8.2 , % 46.66) ، بينما سجلت العزلة Absidia cerymbifera اقل ظهور واقل تكرار(%3.28 , % 5.33) تبعتها العزلة Syncephalstrum racemosum ( % 2.67 و( %1.64 على التوالي. اختيرت العزلة A.terreus SG777 كافضل عزلة لانتاج هذه الانزيمات اذ سجلت اعلى فاعلية نوعية لانتاج الانزيمات المحللة للكنين ( لكنين بيروكسيديز 11.828 ، منغنيز بيروكسيديز1.131 واللاكيز 0.527) وحدة /ملغم . ثبتت الظروف المثلى لانتاج الانزيمات المحللة لللكنين من العزلة الفطرية A. terreus SG 777 باستخدام تخمرات الحالة الصلبة ( سيقان الموز كمادة اساس ، فترة الحضن 8 ايام ،حجم اللقاح1 × 105 بوغ / مل ، برقم هيدروجيني 4.5 وبدرجة حرارة 35م°). رسب انزيم اللكنين بيروكسيديز باستخدام كبريتات الامونيوم بنسبة اشباع %80 ثم ازيل الملح من الانزيم المنتج من عفن777 Aspergillus terreus SG باستخدام طريقة النضح الغشائيDialysis تجاه المحلول الدارئ (Tris buffer) ونقي جزئيا بواسطة كروماتوغرافيا التبادل الايونيIon exchange chromatography باستخدام المبادل الايوني DEAE - cellulose بعدد مرات للتنقية بلغ 5.4 مرة وبحصيلة انزيمية مقدارها %13.7اظهر الانزيم اعلى فغالية وثباتية عند الرقم الهيدروجيني 3.0 ,في حين اقصى فاعلية للانزيم ظهرت عند درجة حرارة 40 م° مع احتفاظ الانزيم بفاعليته عند درجات حرارة تراوحت بين 25) - 35 ) م°. درست قابلية انزيم اللكنين بيروكسيديز في ازالة عدة صبغات واظهرت النتائج اعلى نسبة ازالة ( 83.61 %) للانزيم تجاه صبغة الكونغو الحمراء باستخدام 65.51 وحدة / مل منه وبفترة حضن 4 ساعات وتبعتها صبغة المثيلين الزرقاء بنسية تحطيم %58.6 ثم صبغة المثيل الحمراء بنسبة ازالة بلغت % 49.9.بينما سجلت الصبغات الملاكايت الخضراء ، الالورا الحمراء والتارترازين % 24.87 ,% 28.8 , %26 على التوالي كادنى نسبة تحطيم بوساطة الانزيم قيد الدراسة . درست قابلية انزيم اللكنين بيروكسيديز في ازالة المركبات الحلقية المتعددة التي تم الكشف عنها وذلك لمقارنة فاعلية الانزيم مع نتائج المعالجات في مصفى الدورة والتي تضمنت (المعالجة الميكانيكية، المعالجة الكيميوفيزيائية والمعالجة البايولوجية ) . اظهرت النتائج ازالة 97.54 % للمركب Di benzo (a ,h) anthrancene باستخدام 65.51 وحدة / مل من الانزيم قيد الدراسة وبفترة حضن 4 ساعات وبدرجة حرارة 40 م° في حين بلغت نسبة الازالة بوساطة معالجات المصفى % 54.37 كما بلغت نسبة الازالة لكل من Floureneو anthrancene قد بلغت % 95.98 و% 83.51 على التوالي مقارنة بنسبة الازالة %84.51 , % 46.83 بوساطة معالجات المصفى . قيد انزيم اللكنين بيروكسيديز باستخدام %2 وزن / حجم من الجينات الصوديوم و200 ملي مولار و50 من مل كلوريد الكالسيوم . بينت النتائج ان % 99 من فاعلية الانزيم الحر تم تقييدها .اجريت عملية خزن انزيم اللكنين بيروكسيديز المقيد والحر لمدة اربعة اسابيع عند درجة حرارة 4 م° لمعرفة مدى احتفاظ الانزيم المقيد بفاعليته الانزيمية مقارنة بالانزيم الحر، اذ لوحظ ان الانزيم المقيد قد احتفظ % 88.29 من فاعليته الاصلية بينما احتفظ الانزيم الحر حوالي 66. 02 % من فاعليته الاصلية. استخدم انزيم اللكنين بيروكسيديز المقيد والحر في تحطيم صبغة المثيلين الزرقاء ، اذ اظهرت النتائج ان نسبة التحطيم بالانزيم المقيد بلغت حوالي % 40.1 لفترة حضن 4 ساعات بينما بلغت نسبة تحطيم الصبغة حوالي % 25.79 باستخدام الانزيم الحر وبنفس فترة الحضن .حطم انزيم اللكنين بيروكسيديز المقيد حوالي% 57.89 من صبغة الكونغو الحمراء عند استخدامه لاول مرة ، وانخفضت قابلية الانزيم المقيد على تحطيم الصبغة الى 16.11% عند استعماله للمرة الرابعة. | Eighteen local isolates were collected from seventy five horse manure samples taken from horses in the Equestrian Club in Jadriya and Al - Amrya / Baghdad that were investigated during the 8 months; the period isolation was started from July 2013 to march 2014. Aspergillus niger was the highest occurrence and frequency (80% and 9.8 %) respectively, followed by A . fumigatus (48 % and 9.8 %) and A. terreus (46.66 % and 8.2 % ) occurrence and frequency respectively , whereas Syncephalstrum racemosum (2.67 % and 1.64%) respectively . The isolate A. terreus had the higher specific activity of ligninolytic enzymes (lignin peroxidase 11.828, manganese peroxidase 1.13 and laccase 0.53) U/mg. The optimum conditions of ligninolytic enzymes produced from A. terreus SG777 were estimated using solid state fermentation : banana stalks as a substrate, period incubation 8 days, moisture level 1 : 5 w/v inoculum size 1x105 spores /ml, pH 4.5 and temperature 35 °C. Lignin peroxidase produced from A. terreus SG777 precipitated with 80% ammonium sulfate saturation then desalting by dialysis against Tris buffer solution and partially purified by ion exchange chromatography using DEAE - cellulose. The specific activity reached 56.67U/mg with purification fold was 5.4 times and 13.7% recovery. The optimum pH for activity and stability was 3. The maximum activity was observed at 40°C and the enzyme maintained the activity when it was incubated at 25 - 35˚C. Lignin peroxidase removal the dyes during 4hr. Congo red was decolorized to the maximum extent of 83.61% in 4 hr by 65. 51 U/ml of the pure lignin peroxidase, methylene blue decolorized 58.6% and methyl red azo dye was decolorized to the extent of 49.9% ,while Malachite green triarylmethane dye, allura red and tartarazine showed minimum extent decolorized 26, 28.8 and 24.87% respectively. Degradation of poly aromatic hydrocarbons when incubated with 65.51 U/ml lignin peroxidase at 40 °C for 4 hr compared with the Refinery treatment . Results showed (97.54%) removal efficiency of Di benzo (a ,h) anthrancene by lignin peroxidase, while only 54.37% was treated by Refinery treatment. Flourene and anthrancene degradation 95.98% and 83.51% respectively, while the flourene and anthrancene degradation treated by Refinery treatment only 84.51% and 46.83% respectively. Lignin peroxidase immobilization by 2% (w/v) sodium alginate and 200 mM of calcium chloride. Results showed that 99 % from free lignin peroxidase was immobilized. The stability of immobilized and free Lip enzyme was studied during four weeks; remaining activity for immobilized Lip was 88.29 % from its original activity 76 U/ml during four weeks while free Lip remaining activity was 66. 02 % from its original activity (76.04 U/ml). Methylene blue dye degraded about 40.1% by immobilized Lip during four hr compared with free Lip which has removal only 25.79% from dye concentration. The immobilization lignin peroxidase removal 57.89 % from congo red in first use and then the immobilized lignin peroxidase ability reduced to 16.11% dye removal after four uses.

Author name: خالد اسماعيل عزيز

Supervisor name: رجوة حسن عيسى الربيعي | زيرك فقى احمد عبد الرحمن

General topic: Biology

Specific topic: Microbiology

Degree: Doctorate

University: Mustansiriyah University - College Of Science

Language: Arabic

University location: Baghdad

First pages:

Abstract: تمت جمع مائة وخمسة واربعون نموذجا من الحليب الخام خلال فترة ما بين تموز الى التشرين الثانى لعام 2013 فى مزارع تربية المواشي لمحافظة اربيل ودهوك .اسفرت النتائج عن الحصول على 45 عزلة من بكتريا L. lactis subsp. lactis تمت تشخيص هذه العزلات باستخدام الصفات المجهرية , المظهرية , البايوكيميائية ,API 20E SYSTEM بالاضافة الى تقنية الـ PCR . اختبرت فعالية العزلات لبكتريا L. lactis subsp. lactis تجاه ثلاثه عشر نوعا من المضادات الحيويه وتباينت العزلات فيما بينهما من حيث استجابتها لاختبار الحساسية وعدد منها مقاومة كالاتي : Cephalothin, Ampicillin, Amoxicillin/ Clavulanic acid, Sulfamethoxazole/Trimethoprim, Cefotaxime, Clindamycin, Ceftriaxone, Nitrofurantoin, Gentamycin, Vancomycin, Ciprofloxacin, Chloramphenicol, and Imipenem.، ونسبة المقاومة كالاتي : 95.55%, 93.33%, 93.33%, 91.11%, 84.44%, 77.77%, 71.11%, 62.22%, 53.33%, 40%, 35.55, 24.44%, 2.22%. على التوالي.اظهرت نتائج جميع العزلات فعالية عالية ضد خمسة انواع من البكتريا المرضية وهى : E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa, C. perfringes and S. aureus باستعمال تقنية طريقة الانتشار بالحفر. اظهرت العزلة 41 و15 فعالية عظمى (16mm) (20mm) ضد بكتريا S. aureus وB. subtilis بينما اظهرت العزلة 20 فعالية كبيرة (13mm) ضد بكتريا aeruginosa P.. عموما فان البكتريوسين لجميع العزلات المذكورة كانت فعالة ضد البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة كرام .ايضا تم استخدام النايسين النقي ضد خمسة انواع من البكتريا المرضية واظهرت النتائج بان مناطق التثبيط كانت 18، 22، 14، 13 و15 ملم ضد كل من S. aureus، B. subtilis، C. perfringens، E. coli وP. aeruginosa على التوالي.درست تاثير الاس الهايدروجينى،الحرارة والاشعة الفوق بنفسجية على فعالية نايسين للعزلات 10، 26 و42. اظهرت النتائج بان مستخلص نايسين لعزلة L42 كانت اكثر فعالية عند الاس الهايدروجينى 2.5 والحرارة - 4 م ضد البكتريا المرضية. لم يظهر مستخلص النايسين اى فعالية ضد البكتريا المرضية عند تعريضه للاشعة الفوق بنفسجية مبينا التاثير السلبى لهذه الاشعة على فعالية البكتريوسين.تم اختيار العزلة اكثر مقاومة للمضادات الحيوية (L42) لاجراء عملية التحول وذلك لتحديد مواقع الجينات مانحة المقاومة للمضادات الحيوية باستخدام عملية التحول الوراثي باستعمال بكتريا coli DH5 - α E. الخالية من البلازميدات مع البلازميد المنقى من العزلة L42. تم اجراء عملية التحول بنجاح واظهرت النتائج بان جينات : Chloramphenicol, Nitrofurantoin, Cefotaxime, and Vancomycin كانت واقعة على البلازميد بينما البقية كانت واقعة على الكروموسوم. تم تحديد التركيز المثبط الادنى للنايسين واظهرت النتائج بان MIC للنايسين بالنسبة لبكتريا aureus S. كانت 400µg/ml بينما لبكتريا coli E. كانت 500µg/ml. استخدمت MIC للنايسين كعامل تحييد للسيطرة على جينات مانحة المقاومة للمضادات الحيوية لنوعين من البكتريا المرضية وهى aureus S. وcoli E.. كشفت النتائج بان الجينات منحت المقاومة لـ AMP, OXA, TET, C, CTX, SXT, AK, CFM, تم تحييدها بنسبة 61.5% بينما فى بكتريا coli E. تم تحييد الجينات لـLEV, MEL, NOR, and SXTبنسبة 31%. تم دعم النتائج عمليتي التحول والتحييد باستخدام تقنية الترحيل الكهربائى للهلام. | In this study a total of one hundred forty five raw milk samples were collected during the period of (July to November, 2013) from different fields in Erbil and Duhok province. Screening revealed that 45 out of 145 samples of raw cow milk (31%) were L. lactis subsp. lactis. Characterization of these selected isolates were carried out using morphological, microscopical, biochemical characteristics, API 20 system and further confirmation were achieved by PCR assay.Antibiotic sensitivity test performed for L. lactis subsp. lactis against thirteen antibiotics which include Ampicillin (AMP), Amoxicillin/ Clavulanic acid (AMC), Imipenem (IMP), Gentamycin (GM), Sulfamethoxazole/Trimethoprim (SXT), Cephalothin (CEP), Clindamycin (CLIN), Nitrofurantoin (F), Ciprofloxacin (CIP), Ceftriaxone (CRO), Chloramphenicol (C), Cefotaxime (CTX), and Vancomycin (VAN). The isolates appeared to be varied in their resistance, the number and resistance percent for antibiotics used CEP, AMP, AMC, SXT, CTX, CLIN, CRO, F, GM, VAN, CIP, C, and IMP were as follow 95.55%, 93.33%, 93.33%, 91.11%, 84.44%, 77.77%, 71.11%, 62.22%, 53.33%, 40%, 35.55%, 24.44%, and 2.22% respectively.All supernatants were isolates exhibited marked activity against five pathogenic bacteria includes S. aureus, B. subtilis, C. perfringens, P. aeruginosa, and E. coli using agar well diffusion method. Isolate 15 and 41 exert maximum activity (20 mm) and (16 mm) against B. subtilis and S. aureus. Whereas isolate 20 showed highest activity (13 mm) against P. aeroginosa. Generally, all aforementioned isolates were active against gram positive and Gram negative bacteria. In addition, the effect of pH, temperature and UV light were studied on nisin activities of L10, L26 and L42 against some pathogenic bacteria. The results showed that nisin extract of L42 displayed highest activity at pH 2.5 and temperature at - 4 °C against pathogenic bacteria under study. Under UV light wavelength all nisin showed low or no activity against different pathogenic bacteria selected in this study.Also a pure nisin was used against five pathogenic bacteria and the results shows that the inhibition zones were 18, 22, 14, 13 and 15 mm against each of S. aureus, B. subtilis, C. perfringens, E. coli and P. aeruginosa respectively.One highly resistance isolate was chosen (L42) for transformation test to determine the location of the antibiotic resistance genes by genetic transformation process using the laboratory strain E. coli DH5 - α with plasmid DNA purified from this isolates. The transformation process conducted successfully and the results showed that the resistance genes for F, C, CTX, and VAN were located on plasmid DNA. While for others were located on chromosomal DNA.Minimum inhibitory concentrations were tested for nisin and the results revealed the MIC of nisin for S. aureus was 400 µg/ml while for E. coli was 500 µg /ml. MIC of nisin was used as curing against to control the antibiotic resistance genes in two pathogenic bacteria represented by E. coli and S. aureus. The results showed that the genes encoding resistance to AMP, OXA, TET, C, CTX, SXT, AM, and CFM were cured and the percentage of curing was 61.5%. Whereas for E. coli the gene of LEV, MEL, NOR, and SXT were cured with 31%. The above results of both transformation and curing process were supported with gel electrophoresis.