التحري عن بعض الجينات المسؤولة عن انتاج الغشاء الحيوي لبكتريا Staphylococcus epidermidis المعزولة من عينات سريريه مختلفة == Investigation of some genes responsible for Biofilm Formation in Staphylococcus epidermidis Isolated From clinical samples
Author name:
نهاد خلاوي تكتوك
Supervisor name:
رجوة حسن عيسى الربيعي | سوزان سعدي حسين
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3445 - p.pdf
Abstract:
المكورات البشرويه (Staphylococcus.epidermidis) احدى اهم انواع المكورات السالبه لفحص الكواكيوليز والتي تعتبر الممرض الرئيسي المصاحب للاصابات . تم جمع 645 عينه سريريه اخذت من مصادر مختلفه تضمنت عينات الدم , عينات ادرار القسطره , مسحات الجروح والحروق بالاضافه الى مسحات الجلد والانف من كادر المستشفى,وقد تم زرع وعزل وتحديد العزلات النقيه من مختلف الاجناس البكتيريه وكالتالي : بكتريا الـ pseudomonas .spp. احتلت المركز الاول وبنسبة 19.9% تتبعها مجموعة الـمكورات السالبه لفحص الكواكيوليز 17% تضمنتها : , S.Lentus, S. saprophyticus , S. epidermidis ) S. haemolyticus وS.hominis)وبنسبة ( 68.5 , 13.7, 6.85 , 6.85 و4.1) %على التوالي, تتبعها كلا الـ S. aureus وE. coli وبنسبه (4 16. %)ثم (%16) Klebsiella sp. وProteus (12.9%) ثم بكتريا الـ Serratia marcescens (%1.4) عزله من عينات الدراسه. كل عزلات بكتريا المكورات السالبه لفحص الكواكيوليز كانت موجبه لصبغة كرام , منتجة صبغه بيضاء عدا بكتريا الـ S.saprophyticus والتي انتجت صبغه صفراء وقد اضهرت كل العزلات نتائج سالبة لفحوصات : الاوكسيديز والكواكيوليز لكنها منتجه لانزيم الكتيليز والتي من خلالة تفرق المكورات عن المسبحيات , اضافه لذلك كانت النتائج ايجابيه في اختزال النترات الى نتريت ومقاومه لمضاد الفانكومايسين عدا بكتريا الـ S.saprophyticus والتي كانت مقاومه للمضاد, وقد عرفت كل العزلات بواسطة نظام الـ API staph ونظام الفايتك خلال 6 ساعات. ان كل عزلات المكورات البشرويه كانت غير مخمرة لسكر الزايلوز والسوربيتول والمليببوز بينما مخمرة لسكر الكلوكوز , الفركتوز , السكروز , المالتوز , اللاكتوز والمانوز اضافه الى انتاجها لليوريز , اللايبيز لكنها سالبه لفخصي الدنيز واللسيذنيز. وقد احتلت عينات الدم المرتبة الاولى في عزلات المكورات البشروية وبنسبة 60% يتبعها عينات ادرار القسطرة بالمرتبة الثانيه20%. اغلب المكورات البشرويه عزلت من الذكور 58% مقارنه بالاناث 42% وقد كانت الفئه العمريه الثالثه ( 46 - 65 ) سنه اكثر انتشارا للمكورات البشرويه تتبعها الفئه العمريه الرابعه (>65)وبنسبة 32% وايضا فان نسبة عزل البكتريا من مجاميع الدراسة ( 50, 25 ,15 ,10) على التوالي من عينات ( الدم,ادرارالقسطرة, مسحات الجروح والحروق بالاضافة الى مسحات الجلد والانف من كادرالمستشفى )على التوالي واكثرها في الذكور عدا الفئة العمرية الثالثة حيث كانت النسبة في الاناث 65% عما عليه في الذكور 35% اما انتاجية البكتريا للغشاء الحيوي مظهريا فقد تبين ان 16 % من العزلات كانت منتجة للغشاء الحيوي على وسط الكونكو الاحمر بالرغم من اختلاف المستويات الانتاجية حيث كانت انتاجيتها قوية للغشاء الحيوي (الكونكو الاحمر, الكونكو الاحمر المحور, الكونكو الاحمر المحور الجديد) وبنسبة (2,4,6) % على التوالي بينما كانت متوسطة (4,10,10) % وضعيفة (84,86,94) % على التوالي لهذه الاوساط الثلاثة . وقد بينت نتائج هذه الدراسة عدم وجود فروقات بين هذه الاوساط الثلاثة حيث كانت الانتاجية قوية للغشاءالحيوي على وسط الكونكو الاحمر6% مقارنة بــ (2,4) % على وسطي الكونكو الاحمر المحور والجديد على التوالي بينما كانت متوسطة الانتاجية وبنسبة 10% للكونكو الاحمر و4% لكلا الوسطيين للكونكو الاحمر المحور والجديد . ان انتاجية الغشاء الحيوي المشخصة بالطرق المظهرية الثلاث كانت 60% ايجابية بطريقة الاطباق الماكروية بينما (16,38) % على التوالي لكلا الطريقتين (الانابيب ووسط الكونكو الاحمر) وبنفس الوقت كانت (40,62,84) % على التوالي سالبة للطرق المظهرية الثلاث . فيما بينت المقارنةالمظهرية بين الطرق الثلاث وجود ارتباط قليل بين طريقتي الكونكو الاحمر والاطباق المايكرويه وان انتاجية الغشاء الحيوي قويه وبنسبة18% بطريقة الاطباق المايكرويه مقارنة بطريقتي الانابيب والكونكو الاحمر وبنسبة ( 12, 16) % على التوالي, كذلك منتجه للغشاء الحيوي ( 33.3,83.3,54.5,60) % على التوالي للعزلات المعزوله من عينات الدم ,ادرار القسطره , مسحات الجروح والحروق بالاضافه الى مسحات الانف والجلد من كادر المستشفى وغير منتجه للغشاء ( 40, 16.7,45.5 ,66.7)% على التوالي من مجاميع عينات الدراسه. بالاضافه لذلك فان ( 44)% من عزلات المكورات البشرويه كانت منتجه لجيني الـ PIA بينما)56%) غير منتجه , و10,8 عزله من 30 عزله من البكتريا المعزوله من الدم كانت موجبه لكلا الجينين ICaA وICaD وقد كانت العزلات المنتجه للغشاء الحيوي وجيني الـ PIA بنسبة 77.3 % ( 17 عزله) كانت موجبة للجينين بينما سالبه لانتاجية الغشاء الحيوي والجينين وبنسبة 53.6% . وقد بينت نتائج الدراسة ان 17% من العزلات تحوي الجينين ومنتجه للغشاء الحيوي و16 عزله كانت منتجه للغشاء الحيوي لكنها فاقدة للجينين كذلك 53.6% من العزلات غير منتجه للغشاء الحيوي وفاقده للجينين بالاضافه الى انتشار الجينين (44 , 38)% على التوالي حيث ظهر ان وجود الجين (Ica A) بالبكتريا المعزوله من الدم 33.3% اعلى مما هو عليه من عينات ادرار القسطرة 45.4% يتبعه الجين IcaD بعزلات عينات زرع الدم 26.7% مما هو عليه في عينات قسطرة الادرار 36.3% . وقد اثبتت الدراسه في نتائجها ان كل عزلات المكورات البشرويه المنتجه للغشاء الحيوي لا ترتبط معنويا بوجود جينات الـ PIA ولا علاقه بين وجود الجين IcaD وانتاجيه الغشاء الحيوي , كذلك ظهرت سبعة عزلات منتجه للغشاء الحيوي وحاويه على الجينين (IcaA وIcaD) بطريقة وسط الكونكوالاحمر بينما 15 , 17 عزله كانت ايجابيه للجينين ومنتجه للغشاء الحيوي بطريقة الاطباق المايكرويه , اضافه لذلك فقد وجد ان التلازن الدموي للمكورات البشرويه تلعب دوررائيسيا بالتصاق هذه البكتريا على الاطباق المايكرويه. وقد ظهر من خلال الدراسه وجود علاقه بين كميه الغشاء الحيوي والتلازن الدموي بالاضافه الى ان 13 و18 عزله من 30 عزله كانت على علاقه بالتلازن الدموي ( الفحص العيني والمجهري ) وتكوين الغشاء الحيوي , ووجد ان متوسط الوزن الجاف للغشاء الحيوي المتكون بواسطة المكورات البشرويه المعزوله من عينات الدم كانت 2.7 ملغم لـ 6 عزلات كانت ايجابيه للتلازن الدموي بالفحص العيني بينما 8 عزلات كانت ايجابيه للتلازن الدموي بالفحص المجهري لكن ظهرت بالدراسه( 5 ,6 و2 ,3 )عزلات موجبه عينيا ومجهريا للتلازن الدموي على التوالي مع معدل الوزن الجاف للغشاء الحيوي لها 2.8 ملغم المتكون بواسطة المكورات البشرويه المعزوله من ادرار القسطره ومسحات الجروح والحروق على التوالي بينما عزله واحده فقط من مسحات الانف والجلد لكادر المستشفى كانت ايجابيه لفحص التلازن الدموي مجهريا لكنها سالبه عينيا وبمعدل وزن 2.7 ملغم للغشاء الحيوي , هذه النتائج تؤكد عدم وجود علاقه ارتباطيه بين كميه الغشاء الحيوي المتكون وقابليه تكوينه لكنها تزداد بزيادة عمر الغشاء الحيوي . اما في تفاعل بروتينات مصول المرضى الذين يعانون من التهابات المكورات البشرويه مع المستضدات المكورات البشرويه (خلايا باكملها) فقد كانت النتايج ايجابيه وعلى النحو التالي : ستة من مستضدات المكورات البشرويه اعطت نتائج ايجابيه في عيار 1 : 2، 1 : 4، 1 : 32 و1 : 128 من امصال المرضى , في حين 5، 9، 11 من مستضدات المكورات البشرويه اعطت نتائج ايجابيه في عيار (1 : 16، 1 : 64، 1 : 256) على التوالي,كما اعطى تاثير تركيز بروتين (5.032) ميكروغرام / مل في المصل المرضى المصابين ببكتريا المكورات البشرويه القادرة على تشكيل الغشاء الحيوي تثييطا عاليا وبنسبة 90٪ بينما كان التثبيط 30% في تركيز بروتين المصل (1.394) ميكروغرام / مل.وقد ظهرت نتائج الدراسة مستوى طبيبعي لكل من الاجسام المناعية M وA (90.23±44.23, , 124.4±41.20) و(220.8±90.209, 200.10±79.004) mg/dI على التوالي ولكن سجلت زيادة ملحوظه في المستوي الاجسام المناعيه G (1535±812.333, 1521.3±475.440) mg/dl على التوالي في مصل المرضى المصابين ببكتريا المكورات البشرويه المنتجة وغير المنتجة الغشاء الحيوي، وقد كانت مستويات طبيعية للمتمم C3وبنسبة (120±36.5, 120±36.49) mg/dl على التوالي في مصل المرضى الذين يعانون من اصابات البكنريا المنتجه وغيرالمنتجه للغشاء الحيوي ، بينما مستويات مرتفعة من المكمل C4() (41.9 ± 1.9 1.8 ± 42) mg/dl على التوالي لكلا المجموعتين (المنتجة وغير المنتجة الغشاء الحيوي)، وفي نفس الوقت كان هناك فرقا معنويا بمستويات الانترلوكبن 6 في المصل طبيعية وبتركيز (24.8 ±18.20 , 24.5 ±19.09) pg/ml على التوالي في الامصال من المرضى المصابين بالمكورات البشرويه (المنتجة وغيرالمنتجه للغشاء الحيوي) على التوالي مقارنة بجموعة السيطرة (15.88±6.8) pg/ml (P< 0.001) ، في حين ظهر فرق معنوي في مستويات الانترلوكبن 8 في المصل (38±9.52,37±7.13) pg/ml على التوالي في مصل المرضى المصابين بالمكورات البشرويه (المنتجة وغيرالمنتجه للغشاء الحيوي) على التوالي مقارنة بجموعة السيطرة (20.3±7.07) pg/ml (P< 0.001). | Staphylococcus.epidermidis is one of coagulase negative staphylococci (CONS) are now well established as major nosocomial pathogens associated with infections of indwelling medical devices. A total of 645 clinical samples, taken from different sources include blood, catheter urine specimen, wound and burn swabs and swabs of skin and nasal hospital staff, these sample had been cultured then isolated and identified pure isolates of different genus of bacteria, results show 85 (19.9%) were Pseudomonas spp isolates, 73 (17%) belong to Coagulase Negative Staphylococci (CONS) (S. epidermidis ,S. saprophyticus , S.Lentus , S. haemolyticus and S.hominis constituted 68.5%, 13.7%, 6.85%, 6.85%, and 4.1% Respectively), followed by both S. aureus and E. coli (n = 70 ,16.4%), followed by Klebsiella sp. (n = 68 , 16%), Proteus sp. (n = 55 ,12.9%), Serratia marcescens (n = 6 , 1.4%) isolated from study clinical samples. Most predominant pathogen was Pseudomonas spp (n = 85 ,19.9%), Also, the second most important microorganism which isolated were Coagulase negative Staphylococci (n = 73 , 17%) ,Staphylococcus epidermidis was mainly isolated from study patients group (68.5%) All isolates of CONS species are positive gram stain , produce white pigment except S.saprophyticus which produced yellow pigment, and all isolates gave negative result of oxidase test , coagulase and catalase test was performed for all the isolates and all of them produced catalase enzyme that differentiates Staphylococcus from the genus Streptococcus , so Staphylococcus spp. reduce nitrate to nitrite , and all isolates were identified by using epi staph and VITEK - 2 system within 6 h., CONS are novobiocin resistance except S.saprophyticus. staph.epidermidis isolated were none fermented xylose , sorbitol , melibiose while fermented many sugar as positive results for glucose, fructose, sucrose , maltose, lactose and mannose, in addition to produce urease, lipase and alkaline phosphatase while it cannot produce DNase and lecithinase. Blood samples occupied the first place in isolation S.epidermidis from it a percentage of 60%, followed by catheter urine in the second place 22% . Most of the Staphylococcus epidermidis was isolated from male patients (58 %) compare to female (42%), prevalence of Staphylococcus epidermidis with age were peaked in the third group (46 - 65) years, followed (32%) in fourth age group (> 65) so the most bacterial isolated from four study group (blood, catheter urine specimen, wound and burn swabs , as well as swabs of skin and nasal hospital staff) were (50, 25, 15, 10) % respectively, there was male preponderance in all years age group, excepted in third group, the proportion of females (65%) appeared higher than it is in males (35%). Results of phenotype were shown 16 % of the isolates were biofilm producers with Congo red agar method (CRA), although production level varied. In the biofilm positive S. epidermidis strains on CRA , modified CRA and new modified CRA were 6, 4, 2 ,% respectively of isolates were strong producers, while 10 ,10 ,4% and 84, 86 , 94 % respectively were moderate and weak . In this study results show no differences between CRA and modified CRA and new modified CRA strong biofilm formation was 6% in CRA compare to (4, 2) % to modified CRA and new modified CRA respectively; also moderate produced biofilm was 10% in CRA and modified CRA with 4% in new modified CRA, slime producing which detected by three phenotyping methods 60% of bacterial isolate were positive biofilm produced by microtiter plate , while ( 38, 16%) respectively were positive for both tube and CRA methods, in the same time table 3.10 showed negative result as ( 84 , 62 , 40%) respectively for CRA, tube and microtiter plate method. When compare three phenotype methods congo red agar method showed little correlation with TCP(MTP ) assay and high biofilm formation in TCP 18% compare to both methods ( tube and Congo red agar) as 12 , 16 % respectively, S. epidermidis isolates, which gained from blood , urine catheters, wound and burn swab as well as from swab of skin and nasal hospital staff by (60 , 54.5 , 83.3,33.3) % respectively of the isolates produced biofilm phenotypically while (24, 10, 2,4)% respectively no biofilm phenotypically. Twenty two (44) % of S. epidermidis has PIA gens while 28(56)% negatively for PIA gens, so 10, 8 of 30 S. epidermidis which isolated from blood culture were found to be positive for both IcaA and IcaD , most positive both PIA gene (Ica A, Ica D) and biofilm produced were 17 (77.3%) while negative for both of them and negative biofilm were 15(53.6%)Whilst 5(22.7%) were positive for PIA gene and negative for phenotype (biofilm produce). So prevalence of IcaA, IcaD genes were 44%, 38% respectively , the results indicated that the IcaA gene had the highest rate in blood culture (33.3 %) and catheter urine specimen (45.4%) followed by IcaD gene which was detected in 26.7 % of blood culture while 36.3% of catheter urine specimen. All S. epidermidis slime positive isolates did not reveal any correlation between both PIA genes (icaA and icaD); nonetheless, a correlation was noticed between icaD alone and slime layer production, also seven isolates were potential biofilm producers and positive for both ica genes (A and D) whilst 15, 12 isolate of S.epidermidis were positive for both PIA genes (Ica A and Ica D) and produced biofilm by tube method while 17, 15 strain were positive to both IcaA and IcaD by Mtp methods. So results of this study indicated that presence of PIA genes did not always correlate with biofilm production and hemagglutinin of S.epidermidis may play a major role in the adherence of this organism to microtiter plate. Thus, the hemagglutinin of S.epidermidis may be a virulence factor in the pathogenesis of infection, However, no statistically significant differences were found between the amounts of biofilm formed among the isolates, so founded a good correlation between amount of biofilm formed and the haemagglutination, as well as 13, 18 of the 30 isolate, were the relationship between positive both (Macroscopically and microscopically) hemagglutination assay respectively and biofilm formation So Mean of Dry weights of biofilm which formed by S.epidermidis which isolated from blood was equal to 2.7 mg, and 6 out of 18 isolates have positive macroscopically hemaglutination assay and 8 isolates have positive microscopically hemaglutination assay ,whilst ( 5, 6 and 2,3) isolates have positive macroscopically and microscopically hemaglutination assay respectively with 2.8 mg were the mean of dry weights of biofilm which formed by S.epidermidis which isolated from both catheter urine and wound and burn swabs while only one isolate isolated from swab of skin and nasal hospital staff has positive microscopically hemaglutination assay but negative macroscopically with mean of dry weights biofilm were equal to 2.7 mg, these results indicate no relationship was founded between the amount of biofilm formed and form of biofilm but increasing when increased age of biofilm. Sera from patients with S. epidermidis infections showed reactivity with S. epidermidis antigens (whole cells ) as : six of S. epidermidis antigens agglutinated in titer 1 : 2 , 1 : 4 , 1 : 32 and 1 : 128 of patients sera ( antibodies ) while 5, 9 , 11 of S. epidermidis antigens agglutinated in the patients sera in titer ( 1 : 16 , 1 : 64 , 1 : 256) respectively . Also concentration of sera protein (5.032) µg/ ml gave 90% inhibition but concentration of sera protein (1.394) µg/ ml gave 30% inhibition ,and normal level both for immunoglobulin M and A (90.23±44.23, 124.4±41.20 and 220.8±90.209, 200.10±79.004) mg / dl respectively(p>0.001), but IgG increased level is highly elevated (1535±812.333, 1521.3±475.440) mg / dl respectively(p< 0.001) in sera of patients with produced and non - produced biofilm, and normal levels of (C3) (120±36.5, 120±36.49) mg/dl respectively (P> 0.001), in sera of patients with produced biofilm compare to non - produced biofilm whilst elevated levels of (C4) (41.9±14.09, 42±14.28) mg/dl respectively (p>0.001)to each two groups (produced and non - produced biofilm), so level of cytokines (IL - 6, IL - 8) appear variations between patients and controls, levels of IL - 6 (24.8 ±18.20 , 24.5 ±19.09) pg/ml respectively in sera of infected patients by S.epidermidis (produced and non - produced biofilm) respectively compare to the control (15.88±6.8) pg/ml(P< 0.001), while serum level of IL - 8 (38±9.52,37±7.13) pg/ml respectively in sera of infected patients by S.epidermidis (produced and non - produced biofilm) respectively compare to the control(20.3±7.07) pg/ml (P< 0.001
