التحديد الجزيئي لجين مقاومة مضاد الفنكومايسين في انواع جنس الانتيروكوكس والعنقوديات الذهبية == Molecular Detection of Vancomycin Resistance Gene in Enterococcus Spp. and Staphylococcus aureus
Author name:
هادي حسين عباس القريشي
Supervisor name:
انتصار ناظم خلخال | زهير نعمان حمد العاني
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3451 - p.pdf
Abstract:
تشكل البكتريا التابعة لجنس Enterococcus جزءا مهما من النبيت الطبيعي للقناة الهضميه ،تجويف الفم والمهبل ، وقد برزت في الوقت الحاضر كممرضات مكتسبة من المستشفيات ،وعدت E.faecalis & E.faeciumالانواع العوامل الرئيسه لاصابات المستشفى الحادة ضمن جنسEnterococcus ذات الصلة بالالتهابات الخطرة ويحدث فشل علاج هذه الالتهابات بسبب المقاومة الداخلية (المتاصلة) والاخرى المنتقلة للادوية والعقارات المستخدمة .لذا فقد صممت الدراسة الحالية للكشف عن حركة وانتقال جينات المقاومة ضمن الانواع التابعة لجنس Enterococcus وS.aureus كمكورات موجبة لصبغة غرام(Gram positive) مسببة لاصابات المستشفيات.امكن تقسيم هذه الدراسة الى جزئين رئيسين : الاول : الجانب البكتريولوجي : جمعت (705) عينة ادرار من مصابين بالتهابات المسالك البولية(UTI) من ثلاثة مستشفيات(الكندي التعليمي،ابن البلدي والشهيد الصدر) في مدينة بغداد خلال اربعة اشهر للفترة من(شباط - ايار2014). وقد بينت النتائج ان (105) عزلة منها تعود للجنس Enterococcus.كما تم الحصول على (299) عزلة لبكتريا S.aureus من مجموع (413 )مسحة جروح وحروق .شملت الدراسة مرضى من كافة الفئات العمرية ومن كلا الجنسين.شخصت العزلات العائدة لجنس Enterococcus باجراء اختبارات تمهيدية من خلال زرع العزلات على اوساط تفريقية (Azide blood agar) وملونة (chromo agar UTI orientation ) واخرى محورة(modified media) .كما اجريت اختبارات تاكيدية لتشخيص العزلات الى مستوى النوع وهي : vetik 2 system فضلا عن استخدام بوادئ متخصصة لجينات(primers) ddl للنوعين E.faecalis E.faecium and .لذا امكن تمييز(55)عزلة تعود للنوع E.faecalis(% 7.8) و(50)عزلةشخصت كونها تعود للنوع E.faecium(% 7.1).اما عزلات S.aureus فقد زرعت على وسط اكار المانيتول الملحي (mannitole salt agar)كاختبار تمهيدي لتشخيص العزلات بانها تعود للنوع aureus، ولتاكيد التشخيص فقد تم تنمية العزلات على اوساط اختيارية عالية الدقة والخصوصية شملت(chromoagar S. aureus and chromoagar MRSA) اذ تعتمد نتيجة التشخيص هنا على طبيعة التفاعل الملون بين انزيمات الكائن المجهري المراد التحري عنه وبعض المتفاعلات (reagents) على مثل هكذا اوساط زرعية فضلا عن استخدام (femA gene) البادئ المتخصص بهذا الجين، وقد اظهرت النتائج ان جميع العزلات(299) كانت تعود للنوع ستاف اوريس (162) من عزلات الحروق و(137) من عزلات الجروح.كما اظهرت النتائج ان (135) عزله (100%) كانت مقاومة للمثيسيلين (82) من عزلات الحروق اي مايعادل(60.7%) و(53) من عزلات الجروح اي مانسبته (39.3%).تم التحري عن حساسية جميع عزلاتE.faecium and E.faecalis تجاه المضاد الحيوي فانكومايسين بطريقة Disc diffusion method فضلا عن تحديد التركيز المثبط الادنى (MIC) وقد بينت النتائج ان (20) عزلة من النوع E.faecalis و(20) اخرى من النوع E.faecium كانت بين مقاومة ومتوسطة المقاومة لمضاد الفانكومايسين وقد تم تاكيد النتائج بعد زرع هذه العزلات على الوسط الخاص ببكتريا Enterococcus المقاومة لمضاد الفانكومايسن ((VRE medium،اذ ظهرت المستعمرات بلون وردي مقارنة بالعزلات الحساسة لهذا المضاد والتي تظهر مستعمراتها بلون ازرق .واظهرت (13) عزلة لبكيريا ستاف اوريس مقاومة واضحة تجاه مضاد الفانكومايسين وحددت قيم (MIC) . عزلت بلازميدات المقاومة للفانكومايسين من عزلاتEnterococcusوS. aureusالمقاومة لهذا المضاد بطريقة (plasmid profile) method plasmid extraction وبينت النتائج ان جميع هذه العزلات تحتوي بلازميدات مختلفة الحجام من حيث عدد ازواج القواعد النتروجينية ( Kbp ). ثانيا : الجانب الجزيئي : شخصت عزلاتE.faecalis and E.faecium باستخدام بوادئ متخصصة للجين (ddl) لكلا النوعين كذلك بادئ متخصص للجين fem A لعزلات S. aureus كما استخدمت بوادئ متخصصة للجينات (VanS,R,A and B) ل(40) عزلة لكلا نوعي جنسEnterococcus المقاومة للفانكومايسين واستخدمت نفس البوادئ مع ( 13 ) عزلة S. aureus كانت مقاومة لهذا المضاد . ولتحديد تعاقبات جينات( van R,S and A) للعزلات قيد الدراسة فقد ارسلت نواتج عمليةPCR الى(NCBI) في الولايات المتحدة الامريكة، وقد اظهرت النتائج ان جميع العزلات التابعة للنوعين(E.faecalis and E. faecium) كانت تمتلك جينات (Van R,S,and A) المسؤولة عن صفة المقاومة لمضاد الفانكومايسين وكانت حجوم هذه الجينات1094,733 bp)،650) بالتعاقب ،ولم يتم الكشف عن الجين B في عزلات Enterococcus لكلا النوعين. امكن استنتاج النقاط الاتية من الدراسة الحالية : 1 - اكتسبت عزلات S. aureusالمقاومة نوعA تجاه مضاد الفانكومايسين ، كما ظهر انها تمتلك جينات Van S and R.2 - كانت المقاومة للفانكومايسن في جميع العزلات قيد الدراسة والمقاومة للفانكومايسين هي صفة بلازميدية بسبب فقدانها بعد عمل Curing .3 - اظهرت عملية اجراء التعاقبات للجينات Van S,R and A لعزلات Enterococcusاظهرت تطابقا بم يقارب (99%) مع الجين المرجع من جهة ومع بعضها الاخر من جهة اخرى.4 - بينت تعاقبات جيناتS. aureus (99%) تطابقا مع مثيلاتها في عزلات Enterococcus.5 - كان مصدر المقاومة لمضاد الفانكومايسين هو من عزلات Enterococcusومنها انتقلت صفة المقاومة لعزلات S. aureu | Enterococci form a part of the normal flora of the intestinal tract, oral cavity and the vagina. In recent time; they have become emerged as a nosocomial pathogens. Among Enterococcus genus; Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis are the main causative agents for serious relevant nosocomial infections. The therapeutic failure of enterococcal infections are mainly due to the intrinsic as well as transferable drug resistance,so the current study have been performed to detect the movement or transfer of resistance genes among Enterococcus sp.and Staphylococcus aureus (S.aureus) as a nosocomial Gram - positive cocci. This study could be divided into two aspect : I : Bacteriological aspect : During the period from February / 2014 to May / 2014, one hundred and five enterococcal isolates were isolated from a total of (705) urine samples collected from patients with urinary tract infections (UTI) who attended to three hospitals ( Al - Kindy teaching hospital, Ibn - Al - Balady and Al - Shaheed - Al - Sader ) at Baghdad city .Also 299 isolates of S. aureus were obtained from 413 wound and burn swabs . Patients included in this study were from all age groups and of both genders .The Enterococcus isolates were diagnosed by using the preliminary tests (azide blood agar,chromogenic that included chromoagar UTI orientation , VRE chromagar and modified media). As well as confirmative tests have been conducted for identification of Enterococcus to species level; these tests included vitek 2 System and ddl E.faecalis and ddl E.faecium gene primers ,therefore (55)7.8% isolates were identified as; E.faecalis while (50) 7.1% isolates were detected as E.faecium from 705 urine sample .S.aureus have been diagnosed by preliminary test by culturing the suspected isolates on mannitol salt agar then confirmative test were carried out ; by employing high specialized and accurate chromogenic S. aureus media ( chromagar S. aureus ) , also some of S. aureus isolated identified by vitek 2 system, and other isolates identified by house keeping gene primer special to S. aureus (Fem A gene) ,the results have been shown that;(299)isolates were identified as S. aureus from 413sample was included 232 burn and 181 wound samples . Also from 299 of S. aureus that included 162 isolates from burn and 137 isolates from wound, 135(100%) isolates was methicillin resistance after inoculcated on chromagar MRSA was included 82(60.7%) burn isolates and 53(39.3%) wound isolates. E. faecalis and E. faecium isolates were screened for their antibiotic resistance against vancomycin by disc diffusion test (Kirby - Bauer) method and determination MIC,the results have revealed that (20) isolates of E. faecium and (20) isolates of E.faecium were between resistant and intermediate resistance to vancomycin antibiotic and these results were ensured by culturing of VRE isolates on VRE medium and the colonies showed pink color compared with vancomycin sensitive isolates which appeared blue. As well as the results were showed that (13) isolates of S. aureus were resistant to vancomycin when tested for vancomycin sensitivity and MIC value. Plasmid have been extracted and isolated from those (40) isolates of E.faecalis , E.faecium and 13(8.5%) isolates of S. aureus that were resistant to vancomycin included 8 ( 4.9%)isolates from burn and 5(3.6%) isolates from wound . the results have been showed that all of VRE and S. aureus were contained plasmids with multiple size of Kbp.II; Molecular aspect : E.faecalis and E.faecium have been identified by using the ddl gene primers of both E.faecalis and E.faecium , as well as fem A gene primer of S. aureus . Van S,R, Aand B primer genes special to 40 isolates of Enterococcus that resistant to vancomycin were detected by MIC determination,as well as we used the same primers genes that special to Enterococcus to S. aureus which were resistant to vancomycin and the PCR product were sequencing to comprised each of Van S,R,and A genes in both of bacterial species shown that the results were ,all isolates of E.faecium and E. faecalis should have Van R/S and A genes which were responsible for vancomycin resistance and the size of these genes 650 bp,1094bp and 733bp respectively, no van B gene resistance had been detected among all isolates of Enterococcus of both species . and the conclusion from this study was : - S. aureus gained resistance toward antibiotic vancomycin type A, S. aureus was also harboring van R and VanS genes . - Vancomycin resistance in all isolates of Enterococcus and S. aureus. was a plasmid born character since it has been lost and upon curing of the plasmid - Sequencing of Van R,S and A genes in Enterococcus have shown 99% of alignment with reference gene on one hand with each other on other hand - Sequencing of resistance genes in S. aureus have show 99% alignment with those of Enterococcus . - Members of genus Enterococcus are the source of Vancomycin resistance and from which it transfer to S. aureus. - Vancomycin resistance is a plasmid born characters since it was lostduring curing process using acridine orange.
