Share
دراسة مظهرية وجزيئية للفطريات الجلدية Dermatophytes في محافـظة السليمانية من العراق وتاثـيرالبكـتريا Lactobacillus species كمعزز حيوي == Phenotypic and Molecular Study of Dermatophytes in Sulaimania Province of Iraq and the Effect of Lactobacillus spp. as Probiotics
Author name:
هناء كريم مايخان محمد
Supervisor name:
خالد عبد الرزاق حبيب | شوان كمال رشید
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
University of Baghdad - College Of Science For Girls
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3460 - p.pdf
Abstract:
تضمنت الدراسة الحالية جمع 220 عينة من المرضى المصابين بالفطريات الجلديــــــة dermatophytes (63 ذكور و157 اناث) والذين تم تشخيصهم من قبل الكادر الطبي المتخصص في وحدة الامراض الجلدية في مستشفى كلار العام في قضاء كلار التابع لمحافظة السليمانية فی العراق خلال الفترة من منتصف تشرین الثاني 2014 ولغایة حزیران 2015. وقد شملت العینات الجلد المصاب، تقلیم الاظافر واجزاء من الشعر المصاب حيث وضعت العينات في قناني معقمة محكمة الغلق ونقلت الى مختبر الابحاث التابع لقسم علوم الحياة في كلية التربية/ جامعة كرميان تمهیدا لاجراء الفحوصات المختبریة اللازمة لتشخيص الفطريات الجلدية وقد تم التوصل الى النتائج التالية : من مجموع 220 عينة خضعت للفحص المجهري المباشر بواسطة 10% هيدروكسيد البوتاسيوم KOH ، 200 عينة ( 90.9% ) كانت موجبة لفحص هيدروكسيد البوتاسيوم في حين اظهرت نتائج الزرع المختبري نسبة اصابة كان مقدارها 80 عينة موجبة (36.4%). وبالاعتماد على موقع الاصابة بالجسم احتلت سعفة الجسم Tinea corporis اعلی نسبة اصابة بواقع 31% تلتها سعفة القدم Tinea pedis ، سعفة الاظافر، سعفة اليد، سعفة الفخذ ، سعفة الراس وسعفة اللحية حيث تكررت بواقع 26.5% ، 22.5% ، 8.5% ، 6% ، 5% و0.5% على التوالي. كشف الزرع المختبري عن نمو 80 عزلة من الفطريات الجلدية والتي تعود الى ثلاثة اجناس Trichophyton، Microsporum وEpidermophyton و13 نوع وكان الفطرTrichophyton rubrum هو الاكثر انتشارا وبنسبة 35% من بين الفطريات الجلدية التي تم عزلها وقد عزل النويع Trichophyton rubrum var.raubitschekii لاول مرة في العراق حيث تم عزله من سعفة الفخذ Tinea cruris. الفطر T.mentagrophytes سجل نسبة اصابة 17.5% من الفطريات الجلدية المعزولة تلاه الفطــر M.canis بنسبة 10% وT.tonsurans بنسبة 7.5% . اما الفطريات الجلدية الاخرى والتي شملت T. soudanese; T.interdigitale; T. terrestre فقد تكررت بنسبة 5% ، بينما T.concentricum; T. schoenleinii; T.verucosum; MicrosporumM. audouinii; M.gypsium وE.floccosum فقد تكررت وبواقع 2.5% لكل منها. اوضحت نتائج هضم الجين ITSالواقع في rDNA والتي تم مضاعفتها باستخدام تقنيةPCR عن التعدد الشكلي لطول للجين مابين الانواع المختلفة للفطريات الجلدية المعزولة. حيث اظهرت نتائج هضم الجين ITS لثمانين عزلة من الفطريات الجلدية والتي تعود الى 13 نوع عدد من الحزم المختلفة باستثناء الفطر M.auouiniiوالذي يفتقد الى موقع القطع الذي يعمل عليه انزيم القطع BstN1. ساعدت الدراسة الحالية على رسم العلاقة التطورية ما بين الانواع المختلفة للفطريات الجلدية المعزولة من خلال فحص التسلسل او التتابع الجينـــــــــي Gene sequencing للجين ITS,5.8S,ITS2، وقد حللت نتائج باستخدام برنامج تسلسل قاعدة البيانات Robust Phylogenetic Analysis program لرسم شجرة التقارب الجيني مابين الانواع الفطرية. تم الحصول على 12 سلالة لبكتريا Lactobacillus تعود لتسعة انواع وهيLactobacillus pentosus; Lactobacillus plantarum 1; Lactobacillus plantarum 2; Lactobacillus brevis 1; Lactobacillus brevis 3; Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus collinoides A,B ; Lactobacillus fermentum; Lactobacillus helveticous ; Lactobacillus paracasei وLactobacillus salivarious . اظهرت دراسة الفعالية التثبيطية لانواع وسلالات بكتریا Lactobacillus على الفطرالاكثر تكراراTrichophyton rubrum باستخدام الراشح البكتيري ان النوع L.collinoides A هو الاقوى تاثيرا حيث وصل قطر منطقة التثبيط الى 14mmقبل اضافة الكليسرول ، غير ان النتائج التي تم الحصول عليها بعد اضافة الكليسرول اظهرت فرق كبير في فعالية البكتريا حيث وصل قطر منطقة التثبيط باستخدام النوع ذاته الى 33mm اما قيم MIC وMFC باستخدام طريقة التخفيف فقد بلغت 62.5) و(125 µL\ml على التوالي. اقوى الانواع البكتيرية التي اظهرت فعالية تضادية ضد الفطرT.rubrum باستخدام الخلايا الكاملة شملت L. brevis 3; L. pentosus; L. acidophilus; L.plantarum والتي سببت تثبيط كامل لنمو الفطر كما ان قيم MIC وMFC باستخدام الخلایا الكاملة فقد بلـــــــغت (15.6 و31.3) µL\ml للانواع الـــتالية L. brevis 3; L. pentosus وL.collinoidis A على التوالي ، اما الانواع البكتيرية الطبيعية التي تم الحصول عليها من المهبل وهي L.plantarum 1 وL.acidophilus فقد اظهرت القيم التالية 31.3) وµL\ml (62.5 من MIC وMFC على التوالي. اظهرت نتائج التشخيص باستعمال جهازكروماتوغرافيا السائل عالي الكفاءة HPLC لقیاس تركیز احد مضادات الفطريات وهو Phenylacetic acid (PLA) في الراشح البكتيري لجميع السلالات البكتيرية والتي عددها 12 وتعود لتسعة انواع لبكتريا Lactobacillus بالاضافة الى الكبسولة العلاجية المستخدمة كسيطرة موجبة ان النوع L.plantarum 1 انتج اعلى تركيز من PLA الذي بلغ 19.6 ppmوالذي فاق تركيزه في السيطرة الموجبة البالغ 17.9ppm تلاه L.brevis 3 ثم L.acidophilus حيث بلغ تركيز PLA 17.2ppm و16.4 ppm على التوالي. | Two hundred and Twenty patients (157 females and 63 males) were examined and suspected to be infected with dermatophytes under the supervision of specialized physicians at the Dermatology unit of the General Hospital in Sulaimania Province\Iraq during the period from the middle of November 2014 to June 2015. Specimens were collected from patients included hair fragments, skin scraping and nail clipping which transferred to the research laboratory of Biology Department at College of Education\ University of Garmian, where they immediately examined. Out of 220 clinical specimens were subjected to the direct microscopic examination using 10% KOH, 200(90.9%) specimens were showed positive KOH test, while the laboratory culturing obtained 80(36.4%) positive cultures of dermatophytes. According to the infected sites of the body, tinea corporis was the most common type (31%) followed by tinea pedis, tinea unguium, tinea manuum, tinea cruris, tinea capitis and tinea barbae which were recorded 26.5%, 22.5%, 8.5%, 6%, 5% and 0.5% respectively. Based on the conventional laboratory methods, 80 clinical isolates of dermatophytes showed positive culture which belonging to three genera Trichophyton, Microsporum and Epidermophyton and 13 species, Trichophyton rubrum was the most common species (35%) and Trichophyton.rubrum var.raubitschekii was isolated from tinea cruris for the first time in Iraq. Trichophyton mentagrophytes constitute 17.5% from the isolated dermatophytes followed by Microsporum canis (10%) and Trichophyton tonsurans (7.5%). Other species Trichophyton soudanese; Trichophyton interdigitale; Trichophyton terrestre represented 5% of dermatophytes while Trichophyton concentricum; Trichophyton schoenleinii; Trichophyton verucosum; Microsporum audouinii; Microsporum gypseum and Epidermophyton floccosum constitute only 2.5% of dermatophyte species.The results of PCR - RFLP showed the polymorphism of the Internal Transcript Spacer (ITS) region of the rDNA gene for different species of isolated dermatophytes. The results of the digested ITS PCR products of 80 clinical isolates belonging to 13 species revealed a number of recognition patterns with the exception of Microsporum audouinii which lacked restriction site of the used endonuclease restriction enzyme BstN1. The current study helped to drawing the phylogenetic relationship between the isolated dermatophytes by sequencing of the ITS1, 5.8S, and ITS2 gene. The ITS database sequences introduced Robust Phylogenetic Analysis program to draw the phylogenetic tree between dermatophyte species. Twelve strains belonging to nine species of Lactobacillus were identified as Lactobacillus pentosus; Lactobacillus plantarum 1; Lactobacillus plantarum 2; Lactobacillus acidophilus 1; two strains of Lactobacillus collinoides (identified as A and B); Lactobacillus fermentum 1; Lactobacillus helviticous, Lactobacillus brevis 1; Lactobacillus brevis 3; Lactobacillus paracasi and Lactobacillus salivarious. The study of antagonistic effect of Lactobacilli species and strains against the most frequent species of dermatophytres Trichophyton rubrum using the cell free supernatant (CFS) showed that L. collinoides A recorded the highest inhibition zone reached to 14 mm before addition of glycerol and increased to 33 mm after supplying glycerol into the MRS growth culture for the same species. The results of MIC and MFC values of the CFS were demonstrated by microdilution assay reached to (62.5 and 125) µL\ml respectively.The strongest species of Lactobacillus showed antifungal activity against T.rubrum by using entire cells included L. brevis 3; L. pentosus; L. acidophilus and L. plantarum were completely inhibited the fungal growth and the results of MIC and MFC of the bacterial entire cells reached to the values (15.6 and 31.3) µL\ml respectively for L. brevis 3; L. pentosus and L. collinoides A, in addition to the positive control while vaginal microbiota L. plantarum 1 and L. acidophilus exhibited (31. and 62.5) µL\ml respectively. The results of High Performance Liquid Chromotography (HPLC) analysis of antifungal compound, Phenylacetic acid (PLA) in the fermented CFS of 12 strains belonging to 9 species of Lactobacillus in addition to the probiotic capsule showed that the highest value of PLA was produced by L. plantarum 1(19.6 ppm) which is higher than the positive control (17.9 ppm) followed by L. brevis 3 and L. acidophilus reaching concentration of PLA 17.2 and 16.4 ppm respectively
