Share
تنقية وتوصيف انزيم Protease المنتج من بكتريا Burkholderia cepacia المعزولة محليا == Purification and Characterization of Protease Enzyme from Burkholderia cepacia Local Isolated
Author name:
وســـد لطيف علوان
Supervisor name:
سوسن ساجد محمد علي الجبوري | سامرة يونس يوسف
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3473 - p.pdf
Abstract:
جمعت (165) عينه سريرية من مرضى مراجعين لمستشفيات في بغداد ، و(60) عينه بيئية من التربة والماء . شخص منها (3) عزلات فقط تابعة لبكتريا Burkholderia cepacia من العينات السريرية ، في حين لم تعزل البكتريا من العينات البيئية .استخدم للعزل اوساط زرعية مثل وســـــط اكار ماكونكي ، ووســـــــط اساس اكسدة تخمر المدعم بالبولي مكسين والباستراسين واللاكتـــوز فضلا عـــن الفحوصات المورفولوجية والكيموحيوية ، كما استخدمت العدد التشخيصية API 20E وAPI 20NE . اختبرت قابلية عزلات بكتريا B.cepacia لمقاومة المضادات الحيوية ، واظهرت العزلات الثلاثة مقاومة مشتركة متعددة لاغلب المضادات الحيوية المستخدمة قيد الدراسة ، سيما مضادات المجموعة الامينوكلايكوسيدية والتتراسايكلينات والكونيولينات والبيتالاكتام ، الا انها حساسة لمضاد الببراسلين . اظهرت نتائج التحري عن بعض عوامل الضراوة ، امتلاك جميع العزلات القدرة على انتاج انزيمات الجلاتينيز والبروتييز واللايبيز والبيتالاكتاميز وعوامل السايدروفور، فيما افتقرت لقابلية تحلل الدم ، والبعض منها لانزيم اليورييز. اختبرت قابلية العزلات على انتاج انزيم البروتييز باستخدام وسط الاكار المغذي الحاوي على حليب الفرز (3%)، وتميزت العزلات الثلاث بقدرتها على انتاج الانزيم ، مع وجود اختلاف في الكفاءة ، مما ساهم في انتخاب العزلة المحلية SP1 B.cepacia المعزولة من عينة قشع بكونها الاغزر انتاجا للانزيم . حددت الظروف المثلى لانتاج الانزيم ، اذ كان وسط مرق نقيع القلب والدماغ، ذي الاس الهيدروجيني (7) ، والملقح بـ (106 ) خليه / مل مع الحضن لمدة (24) ساعة في (32) oم هي افضل الظروف لانتاج اكبر كمية من الانزيم . استخلص الانزيم بوساطة النبذ المبرد للمزروع البكتيري ، وتمت تنقيته باستخدام الترسيب بكبريتات الامونيوم بنسبة اشباع (60%) ، ثم استخدم كروموتوغرافيا التبادل الايوني باستخدام المبادل الايوني DEAE - Cellubose ، تلاها كروموتوغرافيا الترشيح الهلامي بهلام Sephadex G - 200 .اذ تم الحصول على انزيم منقى بفعالية نوعية بلغت (341.962 )وحدة/ ملغم وبعدد مرات تنقية (15.02 ) بحصيلة انزيمية (14.65 %)، وقد اظهر الانزيم حزمة بروتينية واحدة عند اجراء الرحلان الكهربائي بهلام متعدد الاكريل امايد تحت ظروف غير ماسخه . قدر الوزن الجزيئي باستخدام الرحلان الكهربائي بهلام متعدد الاكريل امايد بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم وقد بلغ (300 .36)دالتن ، وكان الاس الهيدروجيني الامثل لفعالية الانزيم هو (6.5 ) ، في حين تراوح الاس الهيدروجيني الامثل لثبات الانزيم بين (6 - 8) ، وبلغت درجة الحرارة المثلى لفعالية الانزيم (45)م ، واحتفظ الانزيم بكامل فعاليته عند حضنه مدة (30) دقيقة في درجات حرارة (20 - 50 )م ، وفقد بحدود (83)% منها عند حضنه في (70) o م . اختبرت فعالية انزيم البروتييز المنقى بوجود بعض المواد الكيمياوية ، وتبين ان فعالية الانزيم تثبط كليا بوجود EDTA وSDS ،كما ان الانزيم تاثر قليلا بوجود المواد المختزلــــة مثل 2 - mercaptoethanol وCystein ، ولم يتاثر عند معاملته بمادة Phenyl Methyl Sulfonyl Fluride (PMSF)، وان فعالية الانزيم زادت بوجود ايونات الزنك والمغنسيوم ، وقلت هذه الفعالية بوجود ايونات الزئبق والنحاس مما يشير الى ان الانزيم من نوع البروتيزات المعدنية Metalloprotease . درست التغيرات النسجية لرئات ارانب حقنت عن طريق القصبة الهوائية بالانزيم ذو التركيز ( 0.1( ملغم/ مل و)0.2 ) ملغم / مل ، فكان له تاثير واضحا سيما التركيز الثاني، اذ لوحظ وجود خلايا التهابيه واحتقان دموي مع ضرر كبير للنسيج الرئوي . | Clinical samples (165 ) were collected from patients in some Baghdad hospitals , besid sixty ecological samples have been taken from soil and water. The results revealed that only three isolates from clinical samples were diagnosed as Burkholderia cepacia , while the isolation from ecological samples was not achieved . The isolation was done by using selective media ,morphological, biochemical tests and using diagnosis kits like API 20E and API 20NE. Antibiotic sensitivity test were carried out for B.cepacia .The results showed that the 3 isolates were multidrug resistant towards aminoglycosides ,Tetracyclines , Quinolones and β - lactams , but they were sensitive to pipracillin. The results for screening the virulence factors were showed that all the isolates have the ability to produce many enzymes such us gelatinase ,protease,lipase , β - lactamase and sidrophores but not haemolysin, and one isolate was urease producer. Isolates were tested for protease production using nutrient agar with 3% skim milk .The three isolates were protease producers in different efficiency and the local isolate B.cepacia SP1 (isolated from sputum )showed the highest ability of enzyme production. Optimum conditions revealed that brain heart infusion broth with initial pH(7),inoculum size(106 ) cfu/ml for (24) hours at (32)o C, were the best conditions for greatest amount production of enzyme. The enzyme was extracted by cooling centrifugation and was purified by ammonium sulfate precipitation (60% saturation) followed by ion exchange chromatography on DEAE - Cellulose ,then by gel filtration an Sephadex G - 200 .The purified enzyme had specific activity of (341.962)U/mg with (15.02)purification folds ,( 14.65% ) enzymatic yield and only a single band was observed by polyacrylamide gel electrophoresis under non denat - urating conditions. The molecular weight of the purified enzyme was estimated by using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. It was (36.300) Dalton .The optimal pH for enzyme activity was (6.5),while the optimal pH for enzyme stability was(6 - 8).The optimum temperature for enzyme activity was(45)0 C ,The enzyme was stable for (30)min. at (20 - 50)o C, and lost (83)% of it's activity at (70)oC. The purified protease activity was examined in the presence of some chemical substances .The enzyme activity was completely inhibited in the presence of EDTA and SDS, while it was little effected by 2 - mercaptoethanol and cysteine,on the other hand PMSF had no effect on enzyme activity .The enzyme activity was increased in the presence of zinc and magnesium ions ,but decreased in presence of mercury and copper ions. So the enzyme was from metallo protease type. The pathological changes, that studied for rabbits' lungs after intratracheal inoculation of purified protease, showed inflammantory cells in alveolar walls and extensive damage .
