Author name:
فاطمة مالك عبود
Supervisor name:
محمد صبري عبد الرزاق السعيد | الهام عباس بنيان
Abstract:
تم جمع 103عينة من الصفيحة الجرثومية العميقة (subgingival dental plaque) من المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة المزمن والمتقدم (72, 31) على التوالي لمراجي العيادة الاستشارية لامراض اللثة في كلية طب الاسنان/ جامعة بابل والمركز التخصصي لطب الاسنان في مدينة الحلة. للفترة من كانون الاول 2013 الى حزيران 2014. تم تشخيص وعزل بكتريا P. gingivalis بطرق مختلفة منها استخدام الطرق البكتيرية التقليدية واظهرت النتائج ان 69.5%) 16) منها تم عزلها من التهاب اللثة المزمن وتم عزل 7 (30.5) من التهاب اللثة المتقدم باستخدام التنمية على الوسط الانتقائي الخاص لهذه البكتريا. وكذلك تم استخدام طريقة التشخيص الجزيئي باستعمال المعلم الوراثي المستند على دور جين 16s rRNA حيث اظهر ان12 عزلة من اصل 23 عزلة تم تشخيصها بشكل نهائي انها تعود لبكتريا P. gingivalis. منها حوالي 8 تعود الى التهاب اللثة المزمن و4 تعود الى التهاب اللثة المتقدم. بالاضافة الى ذلك, تم التحري عن قابلية هذه البكتريا للالتصاق(adherence ability) بالخلايا الطلائية المبطنة للفم حيث وجد ان جميع العزلات لها القابلية على الالتصاق بهذه الخلايا وتم ايضا اختبار قابليتها على انتاج انزيم (Gingpain) ووجد ان جميع العزلات منتجة الى هذا الانزيم.في هذه الدراسة تم التحري المظهري عن عملية تكوين الاغشية الحيوية(Biofilm formation) للعزلات المدروسة باستخدام فحص tissue culture plate test (TCP) اذ كانت مكونة للاغشية الحيوية بنسبة 100% وكذلك تم فحص تاثير بعض المواد المستخدمة في طب الاسنان على انتاج biofilm ووجد ان اعلى تثبيط سجل للكلورهكسدين (غسول الفم) والشب (Alum)ويليه تاثير Clove مقارنة باقل تاثير لمادة السعد ((Cyprus rotundus. وكذلك تم الكشف عن حساسية العزلات لبعض المضادات الحيوية ووجد بان كل العزلات كانت حساسة الى Co - amoxiclave وعلى العكس اغلب العزلات تظهر مقاومة عالية لل Amoxicillin بينما سجلت مقاومة قليلة جدا لل Ampicillinو Metronidazole(16.3%, 20.3%, ) على التوالي. واخيرا تم فحص تاثير بعض المواد المستخدمة في طب الاسنان على تثبيط نمو هذه البكتريا وتوضح النتائج ان اعلى تاثير سجل للكلورهكسدين (غسول الفم) والشب (Alum)ويليه تاثير القرنفل(Clove) mm) 25,30,40) على التوالي مقارنة باقل تاثير لمادة السعدC. rotundus (10mm) .في هذه الدراسة ايضا تم التحري عن التغاير الجيني ((TLR - 4 Polymorphisms باستخدام تقنية البلمرة والقطع بالانزيم ((PCR - RFLP. وتبين من النتائج وجود ثلاث انماط جينية في موقع طفرة Thr399Ile : CC وCT وTT ، اذ بلغت نسبة انتشارها ((12.5%,10%,77.5% في مجموعة المرضى على التوالي بينما هناك فقط نمطين في مجموعة السيطرة TT,CCوبنسبة انتشار(36.6% ,63.4%) على التوالي ، فيما بلغت نسبة انتشار الاليلC السائد في المرضى 82.5 % بالمقارنة للسيطرة 63.3% مع وجود اختلاف معنوي. وفي المقابل سجل وجود ثلاث انماط جينية في موقع طفرة Asp299Gly : AA وAG وGG وبنسبة انتشار % 67.5 و12.5% و20% في مجموعة المرضى على التوالي بينما هناك فقط نمطين في مجموعة السيطرة GG, AA وبنسبة انتشار34.4%) 66.6%,) على التوالي. حيث سجلت نسبة انتشار الاليل A السائد (73.75%) في مجموعة المرضى بالمقارنة بمجموعة السيطرة (66.6%) وبفرق معنوي. | In this study, 103 clinical samples were collected from subgingival dental plaque of patients with chronic (CP) and aggressive periodontitis (AP) (72 and 31) respectively, and (n=30) a healthy group admitted to teaching Hospital in college of Dentistry / Babylon University and specialized center of Dentistry in Hilla city, From February 2013 to June 2014). Out of which (n=40) with a chronic periodontitis group from them blood sample were collected for detection of gene polymorphisms in Toll - like receptor - 4 (TLR - 4). These dental plaque samples were subjected to different methods for identification of P. gingivalis mainly traditional bacteriological method. It was found that 23 P. gingivalis isolates were recovered by using selective media where 19 isolates (26.3%) obtained from (CP) and 4 isolates (12.5%) from (AP). Furthermore, molecular detection method was applied by using 16s rRNA gene as a genetic marker for confirmation of detection of P. gingivalis isolates, 12 isolates of P.gingivalis out of 23were detected by molecular method focusing on the role of 16s rRNA gene of P. gingivalis. 8 isolates were isolated from CP, and 4 isolates were isolated from AP subgingival plaques. In addition, these 12 isolates were investigated to detect Adherence of P.gingivalis to oral epithelial cells. The result showed that all isolates have ability to adhere to oral epithelial cells. The study also detected the ability of this bacteria for production of Gingipain, it was found that all isolates were positive for this enzyme at a rate 100%.Furthermore, biofilm formation was tested in the semi quantitative microtiter plate test. The results revealed that all isolates were biofilm former, high and moderate biofilm formation mode were accounted for (50%) while there are no isolates that express non biofilm formation.Regarding to effect of Chlorhexidine (CHX) gluconate (0.12%) on biofilm formation, the results of this study demonstrated (CHX) effectively and reduced the viability of biofilm - forming bacteria from moderate to 25%, weak to 75% and no strong. The study was also evaluating the effect of some plant extracts on biofilm formation. The results showed the highest effect for Alum potassium phosphate followed by Clove, in contrast to lowest effect of C. rotundus. And after screening the effect of Flagyl solution on production of bacterial pigment. The results showed that the metronidazole produced the highest inhibition activity range (30 - 10mm). Furthermore, the susceptibility of isolates to a variety of antibiotics had been investigated and it had been found that all isolates were sensitive to co - amoxiclave and, in contrast, the isolates showed high resistance to other type of beta lactam such as amoxicillin (54.3%). In addition, the result showed that the resistance of p. gingivalis was very low for ampicillin and metronidazole (16.3% and 20.3%), respectively.The screening of antimicrobial activity of (CHX) gluconate (0.12%) was carried out and the results showed that it produced the highest inhibition activity whether against p. gingivalis with inhibition zone range 40 - 15mm. Finally in vitro antibacterial activity of Alum, Clove and Cyperus rotundus plant extracts was studied and the results revealed that all tested isolates were inhibited by aqueous extracts at 50% concentration. The maximum inhibition zone was observed in Alum and Clove extracts respectively (30mm, 25mm), compared to the minimum inhibition by Cyperus rotundus (10mm). The antibacterial actions of 20% concentration of plant extract gave lower inhibition zone than 50% concentration of that extract which represented by (19mm, 16mm, and 10 mm) of the previous three mentioned extracts. This study also aimed to investigate the association of Thr399Ile and Asp299Gly single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the (TLR - 4) with the incidence of (CP).The results revealed at the site of SNPThr399Ile, there were three genotypes for this SNP among CP patients; CC, CT and TT with frequency of 77.5%, 10% and 12.5 % respectively, whereas, there were only two genotypes among control group; CC and TT with frequency of 63.4% and 36.6% respectively with no significance differences between patients and control. However, the frequency of allele C (dominant) was higher among CP group (82.5%) than control (63.3) with significant difference. The site of SNP of Asp299Gly also showed three genotypes among CP patients; AA, AG and GG with frequency of 67.5%, 12.5% and 20% respectively, whereas, there were only two genotypes among control group; AA and GG respectively with frequency of 66.6 and 34.4% respectively with no significance differences between patients and control. However, the frequency of allele A (dominant) was higher among CP group 73.75 % than control 66.6%.
