اسم المؤلف:
اصيل هاشم راضي السعبري
اسم المشرف:
محمد صبري عبد الرزاق السعيد | مشتاق عبد العظيم وتوت
المستخلص:
اللولبية البوابية هي بكتريا سالبة لصبغة كرام, الذي تصيب غالبية سكان العالم وتسبب امراض مختلفة مثل التهاب المعدة المزمن, القرحة الهضمية وسرطان المعدة. في حين ان غالبية الناس المصابين بالبكتريا اللولبية لا تظهر عليهم اعراض مرضية. ان العوامل الرئيسية التي تحدد تطور الامراض ذات الصلة بالبكتريا اللولبية قد تكون ضراوة البكتريا, وعوامل المضيف الوراثية والبيئية.الهدف من هذه الدراسة هو الكشف عن اللولبية البوابية في انسجة المعدة ودراسة عوامل الضراوة الرئيسية لهذا الممرض والعوامل الوراثية للمضيف في المرضى الذين يعانون من اعراض اصابات المعدة والاثني عشري. وتشمل الطرق الجزيئية ايضا تفاعل سلسلة البلمرة (PCR) للكشف عن جينات التشخيص والضراوة لبكتريا اللولبية البوابية وتقنية (SSCP) تم القيام بها للكشف عن الطفرات الجينية ل P53 وال Bax جين التي قد تترافق مع عدوى اللولبية البوابية.بلغ العدد الكلي للنماذج (الخزعات) المعوية 180 نموذج. فقط 92 خزعة معدة (51 ٪) اعطى نتيجة ايجابية لللوليبيات البوابية (Helicobacter pylori ) للتشخيص بواسطة التقنية الجزيئية, مع ذلك من بين هذه النتائج الايجابية 60% منها اعطى نتيجة ايجابية للزراع, التي تعتمد على الميزات الكيميائية الحيوية. كما تم اخذ 100 عينة مصل الدم من افراد اصحاء مع عدم وجود تاريخ عدوى بالبكتريا اللولبية كمجموعة سيطرة ونتائج اختبار الاجسام المضادة على اساس (اختبار المصلية) اعطت نتائج سلبية للبكتريا اللولبية.قد تم ملاحظة وجود تكرار عالي للولبية البوابية بالتهاب المعدة المزمن الذي يشكل 88٪ بينما التكرار القليل كان مقداره 3٫3٪ لسرطان المعدة في حين ان 8٫7٪ كان لقرحة الاثنى عشري. وقد كان التكرار العالي لعدوى اللولبية البوابية بين المصابين الذكور اكثر من الاناث, ويعود سبب ذلك لعدة عوامل مثل (متوسط العمر الاجتماعي والاقتصادي ونقص التغذية وسوء النظافة) ويعتبر التدخين احد العوامل الاضافية المرتبطة مع انتشار عدوى (اللولبية البوابية ) بسبب السلوكيات غير الصحية المرافقة للتدخين , والتي قد تشمل نقل البكتيريا من خلال اللعاب بين المدخنين. من جهة اخرى اظهرت النتائج ان معدل العدوى العالي للمجموعة العمرية (31 - 50) سنة الذي تم تسجيله كان 44٫6٪. علاوة على ذلك فان الكشف عن اللولبية البوابية بتقنية سلسلة تفاعل البلمرة PCR)) قد اجريت على جميع انواع خزعات المعدة وجين (ure C ) اضافة الى جين (ure A ) اللذان يستخدمان كعلامات للتشخيص التاكيدي للولبية البوابية من خلال استخدام (primers ) خاص لتقنية PCR. وضحت النتائج ان 84٫8٪ و73٫9٪ للولبية البوابية كانت ايجابية لكلا الجينين. للعينات التي اعطت نتائج ايجابية (للتضاعف الجيني amplification ) بواسطة (PCR ), كان 56 عينة ما يمثل (60٪) قد اعطت استجابة لنتائج الزرع. اضافة الى التضاعف بواسطة PCR لعلامات جين (ure C ) وجين (ure A ). اضافة الى ذلك ,المعدل الايجابي للولبية البوابية للخزعات تحت الاختبار كان 51٪ بالاعتماد على الكشف الجزيئي المباشر بواسطة (PCR) باستخدام جين (ure A) وجين (ure C ). علاوة على ذلك, تم فحص جين (cag A) لكل عينات اللولبية البوابية التي تم عزلها. اشارت النتائج الى ان65 عزلة (70٫6٪) كانت ايجابية لتضاعف (PCR ) للجين من نوع cagA) ) حيث ان عزلة 56 (60٫8٪) كانت ايجابية لتضخيم (PCR ) للجين من نوع (cag E ). من بين النتائج الايجابية التي تم عزلها 49 عزلة (53٫3٪) كانت قد اعطت نتائج ايجابية للجين من نوع (cag A ). كذلك وجد تكرار الجين (vac A ) مقداره في الدراسة الحالية 68٫5٪ (63/92). اضافة الى كل اللولبيات البوابية الايجابية لخزعة المعدة 49 (53٫3٪) اظهرت اشارة كاملة للجينات نوع (cagA, cagE وvacA (. بالنسبة للعينات المعدية المتبقية 27 عينة (30٫4٪) التي تحوي سلالات سلبية كانت سلبية للجين (cag E). وقد تم تحديد طفرات جين (p53) في الاكسونات 5 و6و 7 و8 باستخدام طريقة SSCP. ومع ذلك تم استخدام PCR لتضخيم الاكسونات 5 و6 و7 و8 للجين (p53) التي من المعروف انها بقع ساخنة طافرة .تحليل PCR - SSCP يكشف تعديلات في الجين (p53) في عدة اكسونات. حيث ان ستة عشر من التعديلات في الاكسون E5A , سبعة عشر التعديلات في الاكسون E5B6A, وكذلك سبعة عشر التعديلات في الاكسون E7 وتعديل واحد فقط في الاكسون E6B لكن لم يظهرتعديل في الاكسون E8 في الجين (p53). بنفس الاسلوب ان تحليل PCR - SSCP كشف عن تعديلات في جين bax في الاكسونات E1 وE4 وE6. ويظهر ذلك في الاشكال. فيما يخص الاكسون 1 في bax يمكن ملاحظة وجود 6 نماذج فقط تعطي طفرات موضع ايجابية للجين. قد يعزى ذلك الى اللولبية البوابية التي تحفز طفرة bax من خلال قابليتها على انتاج بروتين cag A الذي له القابلية على تغيير التسلسل الجيني والوظيفة. واستنتجنا الى ان التشخيص الجزيئي قدم دليلا توكيديا على وجود اللولبية البوابية في عينات المعدة. ايضا قد تؤثر السلالات الاكثر ضراوة على تحفيز طفرات جينية في جينات ال p53 وال bax. | Helicobacter pylori is a gram - negative bacteria which infects a majority of the world population. It causes various diseases such as chronic gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. While majority of the people infected with H. pylori is asymptomatic. The main factors, which determine the development of H. pylori related diseases might be bacterial virulence, host genetic and environmental factors.The aim of this study is detection of H. pylori in gastric tissue and study the main virulence factors of this pathogen and host genetic factors in patients with gasteroduodenal manifestation. Molecular methods include polymerase chain reaction (PCR) for diagnosis and virulence genes of H. pylori and single strand confirmation polymorphism (SSCP) technique was done to detect the p53 and bax genes mutation may be associated with H. pylori infection. In this study, 180 patient were included, only 92 gastric biopsies (51%) gave positive for the presence of H. pylori diagnosed by direct molecular technique. Among these positive result, 60% gave positive results in cultivation based on biochemical features. In addition, 100 serum samples were taken from healthy individuals, with no history of H. pylori infection as a control group and the results of antibody based test (serological test) were negative for H. pylori.In this study, the high frequencies of H. pylori were observed for chronic gastritis, which constituted 88% while low frequencies were 3.3% for gastric cancer, whereas 8.7% for duodenal ulcer.Also, the highest frequencies of H. pylori infection were found in male patients in comparison to female. On the other hand, the results showed that the high significant infection percentage 44.6%, among age group ranging from 31 - 50 years. Moreover, detection of H. pylori by Polymerase Chain Reaction (PCR) technique is performed on all gastric biopsy. ure C as well as ure A genes are used as markers for confirmatory diagnosis of H. pylori through using specific primers of PCR technique. The results show that 84.8% and 73.9% of H. pylori are positive for both genes, respectively. Among samples with positive result for PCR amplification, 56 samples (60%) also had positive culture result. Besides, the PCR amplification of ureC and ureA markers. Also, the rate of positive H. pylori in the tested biopsies was 51% depending on direct molecular detection by PCR using the ureA and the ure C genes.In addition, cag A gene is investigated in all H. pylori isolates. The results show that 65 isolates (70.6%) are positive for PCR amplification of cagA gene whereas 56 isolates (60.8%) are positive for PCR amplification of cag E gene. Among of these positive isolates, 49 isolates (53.3%) give positive result for cag A gene. The frequency of the vacA gene found in the present study is 68.5% (63/92).Furthermore, among of all H. pylori positive gastric biopsy, 49 (53.3%) reveal full signals of cagA, cagE, and vacA. The remaining 27 (30.4%) gastric biopsies, harboring cagA - negative strains, are PCR negative for cagE.Mutations of the p53 gene in exons (5,6,7 and 8) are identified by PCR - SSCP method. However, PCR is used to amplify exons 5,6,7 and 8 of p53 gene which are known to be mutational hot spots. PCR - SSCP analysis has detected alterations in the p53 gene in several exons. Where sixteen alterations in exon E5A, nineteen alterations in exon E5B6A, seventeen alterations in exon E7 and only two in exon E6B but no alteration is seen in exon E8 of P53 gene.In the same way, PCR - SSCP analysis detected alterations in Bax gene where only 17% of positive samples gave alteration in the sequence of Bax gene in exons E1, E4 and E6. Regarding exon 1 of Bax gene, it was seen that only 6 samples gave positive gene locus mutation. It conclude that the molecular diagnosis gave an evidence and confirmatory guide on the existence of H. pylori in gastric samples. Also the more virulent strain may be affected on the stimulation of p53 and bax genes mutation.
