اسم المؤلف: سمير عبد الامير عبد علي علـش

اسم المشرف: رشيد محجوب مصلح | علي عبد الرحمن طه

الموضوع العام: علوم الحياة

السنة: 2008

الموضوع الدقيق: الاحياء المجهرية

الدرجة: دكتوراه

الجامعة: جامعة بغداد

اللغة: العربية

مكان الجامعة: بغداد

الصفحات الاولى:

المستخلص: ا عتمد في اجراء هذه الدراسة على 20 عزلة مرضية من بكتريا Staphylococcus aureus ا خذت من مختبر الصحة المركزي مشخصة باستعمال نظام ابي للعنقوديات (API - Staph . Ident . System) . ا عيد تشخيص جميع العزلات عن طريق استخدام الاختبارات الكيموحيويه من اجل التثبت بشكل دقيق من هويتها ، وقد جاءت العزلات جميعها متوافقة مع تشخيص مختبر الصحة المركزي . ا ستخدم اختبار التلازن الدموي ( (Haemagglutination test في التحري عن وجود بروتين A في عزلات S . aureus المشخصة جميعا ، وقد اظهر هذا الاختبار تباينا ملحوظا في نسبة امتلاك هذه العزلات لبروتين A . فقد برزت العزلات ذوات الارقام 1 ، و5 ، و6 ، و7 ، و9 بوصفها عزلات ذات محتوى عال من بروتين A . اما العزلات ذوات الارقام 8 ، و10 ، و11، و12، و13، و14 ، و15، و17، و18، و19 ، و20 ظهرت انها ذات محتوى متوسط من بروتين A . فقط العزلة ذات الرقم 16 ظهرت انها فقيرة المحتوى من بروتين A . بينما كشف ووفق الاختبار المستعمل عدم امتلاك العزلات 2، و3 ، و4 اي محتوى من بروتين A . ا نتخبت العزلة رقم ( 1 ) كعزلة مثالية من اجل انجاز هذه الدراسة لكونها تميزت بمحتوى عال من بروتين A فضلا عن انها تقدمت على بقية العزلات في اعطاء النتيجة الموجبة لاختبار انتاج انزيم Coagulase ، وكذلك في اظهار تحللا كاملا وشديدا في اختبار انتاج حالة الدم Hemolysin . ا ستخلص بروتين A الخام (Crude protein A) على مرحلتين . كانت المرحلة الاولى باتباع طريقة (Lind , (1974 ( طريقة التعليق بالصوديوم ازايد ) بوصفها طريقة سهلة وغير مكلفة في الحصول على مستخلص بروتين A المرتبط بجدار الخلية العنقودية للعزلة رقم ( 1 ) (Cell - bound protein A) بشكل كامل مع الحفاظ وبدرجة عالية على وحدة التركيب البنائي لبروتين A من اية تشوهات . اما المرحلة الثانية كانت باتباع طريقة ( Seki et al .,( 1985 طريقة مكملة للطريقة الاولى وذلك بترسيب بروتين A الطافي بكبريتات الامونيوم ( 85 % اشباع ) مع بقاء بروتين A المترسب محتفظا بفعاليته . ا دخل مستخلص بروتين A الخام عملية التنقية ( Purification) وهي كذلك كانت على مرحلتين . المرحله الاولى استخدمت فيها طريقة كروماتوغرافيا التبادل الايوني (Ion - exchange chromatography) بعمود ( DEAE - Cellulose ). اما المرحلة الاخرى فقد تضمنت استخدام طريقة كروماتوغرافيا الترشيح بالهلام (Gel - filtration chromatography) بعمود Sepharose CL - 6B) ) . انتهى استخدام الطريقتين في الحصول على مستخلص بروتين A منقى ( Purified protein A ) .ومن اجل التحري عن احتفاظ مستخلص بروتين A الخام والمنقى بفعاليته استخدم اختبار الانتشار المناعي الثنائي في الهلام الذي اعطى نتيجة موجبة بتكون الخطوط الترسيبية التي نتجت من تفاعل مستخلص بروتين A الخام والمنقى مع IgG لمصل دم خنزير غينيا .قدر تركيز مستخلصات بروتين A ( الخام والمنقى جزئيا والمنقى ) باتباع طريقةBradford, ( 1976 ) . حيث بلغت التراكيز 63 مايكروغرام / مليلتر لمستخلص بروتين A الخام ، و42 مايكروغرام / مليلتر لمستخلص بروتين A المنقى جزئيا ، و36 مايكروغرام / مليلتر لمستخلص بروتين A المنقى .تم استخدام الفئران البيض من نوع ( Balb C ) من اجل الوصول الى التاثيرات المرضية لمستخلص بروتين A المنقى . حيث حقن المستخلص بطريقة الحقن داخل البريتون Intraperitonial injection)) بعدد سبع حقنات ، وبمعدل 0.1 مليلتر لكل حقنة ( ذو التركيز 36 مايكروغرام / مليلتر ) ، يفصل بين حقنة واخرى يوم واحد . اظهرت مجموعة فئران البحث المحقونة ببروتين A المنقى على المستوى السريري خمولا عاما بدا واضحا بعد الحقنة السادسة . لم تظهر اية تغيرات مظهرية جلدية في مناطق الحقن كما لم تحدث وفيات . بعد قتل الفئران وتشريحها جميعا ا ستاصلت اعضاء القلب ، والطحال ، والكبد ، والكليتين ، والامعاء ، والمعدة ، واخيرا الرئة . وبالموازنة مع اعضاء فئران السيطرة لوحظ حدوث تضخم كبير في الطحال . كما اظهر الكبد تضخما ملحوظا وهذا سجل في الفئران المحقونة ببروتين A المنقى . لم يسجل حدوث تغيرات على المستوى المظهري في اعضاء القلب ، والامعاء ، والمعدة ولكن لوحظ وجود بقع سوداء اللون على السطح الخارجي لنسيج الكبد ، والكليتين ، وهو ايضا سجل في فئران الدراسة اجمع .اهم ما برز في هذه الدراسة هو حجم التاثير المرضي الذي اصاب عضو الرئة حيث ظهر بشكل غريب فقد بدا النسيج يميل الى السواد ببهوت وهو ما كان واضحا في سبعة من فئران الحقن ، اما الثلاثة الباقية شوهدت الرئة فيها خلال التشريح وهي مغطاة بعض من اجزائها بالدم .كشف الفحص النسيجي لاعضاء القلب ، والامعاء ، والمعدة عدم وجود اية تاثيرات مرضية ناتجة من حقن بروتين A المنقى . اما الطحال فقد شهد حدوث توسع كبير في منطقة اللب الابيض White Pulp)) مع احتقان دموي بارز وانتشار للخلايا المولدة للصفيحات الدموية (Megacaryocytes) . اما الكبد فقد برز فيه حدوث تلف بسيط (Mild degenerative change) في خلايا الكبد مع ارتشاح خلايا احادية النواة (Monocytes) خصوصا في المنطقة البوابية التي بدت متوسعة نوعا ما . كما لوحظ زيادة في خلايا كبفر ((Kupffer cells في عموم نسيج الكبد . الكليتين شهدت بروز زيادة في الخلايا المكونة للكبيبة الكلوية ( Glomeruli) والتي يطلق عليها ( Mesengial cells ) .عضو الرئة تضمن الفحص النسيجي له تاثيرات عدة وهي كما يلي : 1 - احتقانات دموية كبيرة ( Bloody congestions ) .2 - وذمة ( Oedema ) .3 - ارتشاح خلايا التهابية ( Inflammatory cells infiltration) .4 - توسع في الفسح القصبية ( Alveolar spaces) مكونا ما يسمى بظاهرة Emphysema)) اي انتفاخ حويصلات الرئة . بدت الرئة للفئران المحقونة جميعا ببروتين A المنقى اكثر الاعضاء التي اظهرت تضررا نسيجيا كبيرا موازنة بالضرر في بقية الاعضاء .تم اجراء اختبار التحري عن السمية الخلوية لبروتين A المنقى باستخدام تقنية مزرعة الخطوط الخلوية الطبيعية ( Normal cell lines - culture ) حيث اعطى الاختبار نتيجة سالبة اي عدم امتلاك بروتين A المنقى تاثيرا سميا (Toxic effect) في الخلايا النامية . | This study dealt with ( 20 ) diagnosed isolates of Staphylococcus aureus by "API - Staph . Ident . System". which were taken from the central health laboratory . The diagnosis was repeated so as to confirm the identity of those isolates by using biochemical tests whose results were the same as those of the central health laboratory .The haemagglutination test was used to investigate the presence of protein ( A ) in all S . aureus isolates . The results markedly showed differences in content concerning the ratio of this protein , thus isolates numbered 1 , 5 , 6 , 7 and 9 gave high content of protein ( A ) , but the isolates numbered 8 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 17 , 18 , 19 and 20 gave medium content of protein ( A ) . Isolate numbered 16 was the only isolate that has low content of protein ( A ) . On the other hand , isolates numbered 2 , 3 and 4 gave no content of protein ( A) .The isolate number ( 1 )has been chosen as an optimal isolate to accomplish this study , Because of its high content of protein ( A ) , furthermore it was the best isolate in getting positive result concerning the test of coagulase production , and in giving a complete and intensive result concerning the test of hemolysin production . Crude protein ( A ) was extracted by two steps : Lind method ( Lind , 1974 . ) "Suspending in sodium azide" was followed at the first step as an easy and a cheap method in getting a thorough cell - bound protein ( A ) extracted from the isolate number ( 1 ) with high preservation of the structural unit without any deformation .The Seki et al .,( 1985 ) method was followed in the second step as a completion method to the first one , by the precipitate of the supernatant protein ( A ) using ammonium sulfate ( 85 % saturation ) . The function of precipitated protein ( A ) was perfect . In order to get a purified protein ( A ) extract from crude protein A , purification was accomplished by two steps : Ion - exchange chromatography by DEAE - cellulose column was used in the first step , While Gel - filtration chromatography by Sepharose CL - 6B column was used in the second step . Double immunodiffusion in gel was used to investigate the preservation of the crude and purified protein ( A ) with its full function . This test gave a positive result by forming the precipitate lines as a result of the interaction between protein ( A ) ( Crude and Purified ) and IgG of guinea pig sera .Bradford method was used to estimate protein ( A ) extracts concentration ( Crude , Partial purified , Purified ) . The estimation was 63 microgram / ml for crude extract , 42 microgram / ml for partial purified extract and 36 microgram / ml for purified extract .white mice ( Balb C ) were used to investigate the pathogenic effects of purified protein ( A ) . Intraperitonial injection method was used to inject 0.1 ml of 36 microgram / ml of purified protein ( A ) for 7 times with a one - day separating period . The injected mice with purified protein ( A ) showed general weakness which was very clear after the sixth injection . there were no phenotypic dermal change in the injection area , and no dead mice as well .After killing and dissecting of all the mice , the organs of heart , spleen , liver , kidney , intestine , stomach and lung were eradicated . There were a great enlargement in spleen and a little in liver in all injected mice in comparison with the control mice . No phenotypic changes appeared in heart , intestine and stomach , but black spots were shown on the outer surface of kidney and liver tissue which were presented in all the injected mice . The most important results in this study is the great size of pathogenic effects in lung . The shape of its tissue seemed strange and tended to be faint black with which was obvious in seven mice . The lung of the three others ( some parts ) showed during anatomy covered by blood .The histological check for heart , intestine and stomach showed no pathogenic effects resulted from protein ( A ) injection . In the spleen , there was a huge expanding in the white pulp region , with blood congestion while the spreading of megacaryocytes has increased . The liver showed mild degenerative change in liver cells with monocytes infiltration especially in the entrance region which appeared expanded . Also there was an increase in kupffer cells in all liver tissue .Kidney showed increase in mesengial cells which are concedered the forming units of glomeruli .The histological check of lung included the following : 1 - Bloody congestions .2 - Oedema .3 - Inflammatory cells infiltration .4 - Alveolar spaces expanding forming '' Emphysema '' .The lung was the most effected organ that showed tissue injury among other all organs . The normal cell lines - culture technique was followed to investigate cellular toxicity of the purified protein ( A ) which gave a negative result , that means , there was no toxic effect of purified protein ( A ) on the growth cells .