Author name:
غـفـران فـلـيـح عـبد الـحـسـن عـزيـز الجـبـوري
Supervisor name:
فاطمة عبد الحسين مجبل التميمي
University location:
Najaf
Abstract:
تم الحصول على 102عزلة من العزلات البكتيرية من 40 عينة من عينات الترب الملوثة بالنفط من مختلف المناطق ورشة عمل السيارات، محطات وقود السيارات، مصافي النفط ولخمسة مناطق مختلفة في العراق . خضعت كل هذه العزلات الى الفحص المجهري والخصائص الزرعية ووجد ان 80 عزلة منها تنتمي الى جنس Bacillus ، هذه العزلات خضعت ايضا لاختبارات بايوكيميائية وشخصت بناءا على دراسة rDNA 16S من قبل مجموعتين من البرايمرات (andB16SF B16SR) و(1492R and 27 F) اذ وجد ان 51 عزلة منها تعود الى Bacillus subtilis . تم فحص جميع هذه العزلات من حيث قدرتها على انتاج biosurfactant عن طريق فحص النشاط انحلال الدم على وسط دم الاغنام حيث وجد ان جميع العزلات كانت من النوع تحلل الدم بيتا حيث تم فحصها اعتمادا على قياس الشد السطحي بعد زراعتها في Jacques medium اظهرت النتائج ان 46 عزلة من 51 عزلة كانت منتجة biosurfactant , وقد تم اختيار ثمانية منها تميزت بانتاجها لهذا المركب وهي (S1,S2,S3 S4,S5,S6,S7,S8) حيث كانت العزلة B. subtilis S4 هي الاكفا في الانتاج لذلك اختيرت في الدراسات اللاحقة . تم استخلاص Biosurfactant الخام من العزلات المختارة بواسطة وتنقيته جزئيا باستخدام طريقة Ion exchange chromatography باستخدام DEAE - Cellulose تلاها طريقة Gel filtration chromatography باستخدام Sepharose - 6B . تمت دراسة خصائص المركبات المنقاة واظهرت النتائج ان الوزن الجزيئي biosurfactant التي تنتجهاB.subtilis S4 تراوح بين (1036 - 1058دالتون) من خلال جهاز HPLC - TOF - MS . اظهرت النتائج ان الحد الاقصى لانتاج biosurfactant من العزلة تم بطريقة استخدام زيت الزيتون (3٪) وكبريتات الامونيوم (0.3٪) وKH2PO4 (1.5) غم / لتر، وبدرجة حرارة 30 مº والاس الهايدروجيني (7) وفترة الحضانة لمدة 72 ساعة. وقد تحققت اعلى نسبة للـ biosurfactant بعد مكملات الظروف المثلى الى 0.3 غرام / لتر من الوسط الزرعي . تم اختبارالنشاط البكتيري والفطري للعزلات الثمانية ضد بعض الجراثيم المسببة للامراض، وهي Staphylococcus aureus,Streptococcus pneumonia, Pseudomonas aeruginosa ,Escherichia coli ,Proteus mirabilis, Candida albicans , Candida tropicalis , Candida krusei , Rhizopus oryzae , Aspergillus niger وكانت العزلة الاكثر فعالية هي B.subtilis S4 التي اظهرت وجود نشاط ضد كل مسببات الامراض ماعدا S.pneumonia ,P.aeruginosa ,C.krusei . كما بينت النتائج ان مستخلص العزلة B.subtilis S4 اظهر اعلى تثبيط نموعند التركيز 1500 مايكروغرام / مل وصل الى 24 ملم ضد E.coli، 23 ملم ضد K.aerogenes، 21 ملم ضد S.aureus، 15 ملم ضدC.albicans، 14 ملم ضد P.mirabilis، 11 ملم ضد C.tropicalis، وتثبيط نمو الفطريات، حيث وصل معدل النمو الشعاعي الى 31.9 ملم ضد A.niger و9.7 ملم ضد R.oryzae عند التركيز 2 ملغم / مل. كذلك اظهرت النتائج ان سمية المستخلص B.subtilis خارج الجسم الحي على ذكور الجرذان البيض بلغت حوالي 922 ملغم / كغم وتشير اذ ان الاعطاء اليومي biosurfactant لم تظهراي حالة وفاة في اي جرعة ، ولم تلاحظ اي تغييرات غير عادية في السلوك اوتاثيرات سمية خلال فترة 28 يوما من العلاج. واثبت التحاليل انه ليس هناك اي تاثير سلبي على معايير الدم الفسلجية وهذا يؤكد صحة هذه المستحضرات الحيوية للاستخدام . | About 102 bacterial isolates were obtained from 40 oil contaminated soil samples from various automobile work shop ,cars fuel stations ,oil refineries of five different areas in Iraq. Microscopic examination and cultural characteristics for all isolated were investigated , 80 isolates were found to be related to the genus Bacillus , Bacillus isolates were subjected to the biochemical tests and molecular identification based on the 16S rDNA by two sets of primers (B16SF and B16SR) , (27F and 1492R) of these 80 isolates revealed that 51 of the identified isolates belonged to Bacillus subtilis.All these isolates were screened for their ability for biosurfactant production through blood haemolysis activity on sheep blood agar indicated that all isolates were β - hemolysis while screening depended on measuring the lowering surface tension of cell free supernatant after cultivation in jacques medium which referred that 46 of 51 isolates were biosurfactant producers. Eight isolates were selected for the best biosurfactant producer isolatesCrude biosurfactants produced by the selected isolates were extracted by acid precipitation followed by partially purified with dichloromethane followed by purification and characteristics, the results showed that the molecular weight of biosurfactant produced by B.subtilis S4 ranging between 1036 - 1058 Da . Optimum conditions for biosurfactants production from B. subtilis S4 were determined. Results showed that maximum biosurfactant production from this isolate was achieved by using 3% olive oil , 0.3 % ammonium sulfate and 1.5 g / l Potassium dihydrogen phosphate ,at pH7,30 ºC and incubation period for 72 hrs. Maximum biosurfactant production was achieved after the supplementation of the optimum conditions was 0.3 g/l of culture medium .All of the eight isolates were tested for antimicrobial activity against twelve pathogenic microorganisms : Staphylococcus aureus ,Streptococcus pneumonia,Pseudomonas aeruginosa ,Escherichia coli ,Proteus mirabilis Klebsiella aerogenes,Candida albicans,C.tropicalis,C. krusei , Rhizopus oryzae , Aspergillus niger and Penicillium notatum.The most effective isolates were B.subtilis S4 which showed antimicrobial activity against some tested pathogens except S.pneumonia ,P. aeruginosa ,C.krusei and P.notatum.The results indicated that S4 culture extract showed high growth inhibition zone in concentration 1500 µg /ml reached to 24 , 23, 21, 15, 14 and 11 mm against E.coli , K.aerogenes , S.aureus , C.albicans, P.mirabilis,C.tropicalis respectively and high reduction in of radial growth of the fungi reached to 31.9 and 9.7 mm in A.niger and R.oryzae respectively at 2 mg /ml concentration .Study in vivo potential toxicity of B.subtilis lipopeptide biosurfactant towards male rat was evaluated. An LD50 value was determined to be about 922 mg / kg. Results show that daily administration of biosurfactant did not show any death cases at any dose. Also, no unusual changes in behavior and no intoxication were observed during the 28 days period of treatment. Analysis proved that there were no significant adverse effect on hematological parameters and this confirms the validity of those biopharmaceuticals on body of mammals.
