اسم المؤلف:
ميس عماد احمد محمود
اسم المشرف:
شذى سلمان حسن
المستخلص:
درست قابلية (15)عزلة من بكتيريا Serratia marcescenase على انتاج الكايتنيز, واظهرت نتائج الغربلة الكميه وشبه الكمية ان العزلةSerratia marcescenaseA1S هي الاغزر انتاجا للانزيم . زرعت البكتيريا في اوساط تخمر صلبة وسائلة مختلفة استعملت مواد نباتية مختلفة ( مضافا اليها الكايتين وبدونه ) لتحضير الاوساط الصلبة ، اما الاوساط السائلة فقد احتوت على الكايتين مع مواد نيتروجينية مختلفة . بينت النتائج الماخوذه من قياس فعالية الانزيم على اساس تقدير السكريات المختزلة والسكر ان استيل كلوكوز امين ان البكتيريا تنتج انزيمات الكايتينيز الداخلي chitobiosidase) ) الذي يحرر سلاسل من السكريات المختزلة والكايتنيز الخارجي chitobioase ) ) التي تحرر وحدات السكر الامينيN - acetyl D - glucosamine )) ، وكانت فعالية الكايتنيز الخارجي اعلى من الداخلي عموما ، وتبين ان الاوساط السائله تعطي انتاجية اعلى من اوساط التخمر الصلبة. نميت البكتيريا في الوسط السائل بظروف مختلفة ، ووجد ان الظروف الافضل لانتاج الانزيم هي اضافة البكتريا بعدد خلايا 104 × 2.2 خلية / مل الى الوسط الحاوي على الببتون بوصفه مصدرا للنتروجين 2 % من الكايتين الغروي وحضنها بدرجة 30 م عند الرقم الهيدروجيني ( 7 ) لمدة 4 ايام في الحاضنة الهزازة بسرعة 150 دورة / دقيقة ،وبلغت الانتاجية 9.5 وحدة/ملغم بروتين. رسب الكايتنيز في وسط الانتاج بعد تنمية العزلةmarcescenas A1S Serratia باضافة كبريتات الامونيوم بنسبة اشباع 75% ، وكانت الفعالية النوعية 9وحدة/ ملغم بروتين , وقد حققت هذه الخطوه تنقية جزئيه للانزيم وكان عدد مرات التنقيه5.6 بحصيله انزيميه مقدارها%80 . درست بعض العوامل المؤثره في فعالية وثبات الانزيم ، ولوحظ ان الرقم الهيدروجيني 7 هو الافضل للفعالية ، وتراوحت الارقام المفضلة لثباته بين 6 - 9 , وكانت اقصى فعالية للانزيم عند درجة 30 م . احتفظ الانزيم بنسبة 65 - 100 % عند حضنه بدرجات حرارة تراوح من 30 - 60 م لمدة 30 دقيقة ، وبقى محتفظا بـ 57 % من فعالية عند درجة 80 م. درس تاثيربعض المواد والمثبطات في فعالية الكايتنيز ولوحظ عدم تاثر الانزيم بـ EDTA وازايد الصوديوم والـPMSF بتركيز5 و10 ملي مولار . درس تاثير بعض الايونات الفلزية في فعالية الكايتنيز ولوحظت زيادة فعالية الانزيم عند حضنه مع ايونات الصوديوم Na+2 اذ وصلت الى 150 % . لم يتاثر الانزيم بايونات Mn +2 ، وFe+2 ،و Ca +2 ،و 2+ K وثبطت فعالية الانزيم عند معاملته بايونات Cu +² Zn +2, , Hg+2 بتركيز 5 ملي مولار اذ انخفضت الفعالية الى 31 , 50 , 55 % على التوالي وانخفضت الفعالية الى 25 ، 43 ، 50 % بتركيز 10 ملي مولار على التوالي عند المعاملة بهذه الايونات . قيست الفعالية المضادة للانزيم اتجاه انواع مختلفة من الكائنات الحية ، وبينت النتائج ان للانزيم فعالية مثبطة واضحة ضد خميرة الـ Candida albicans , حيث ظهرت مناطق عدم نمو واضحه للخميرة المعاملة بالانزيم ، وعند معاملةالقواقع البحرية Achatina fulica بالكايتنيز ظهرت تغيرات مظهرية عليها اذ لوحظ تنخر في اصدافها وفقدان فعاليتها. بينت النتائج ان تعريض يرقات حشرة خنفساء الطحين المتشابه Tribolium confusum للكايتنيز له تاثير قاتل للحشرة حيث فقدت حيويتها ، وظهر تحلل كامل في طبقة الكايتين التي تغلف سطح جسم اليرقة. يتضح من هذه النتائج ان الكايتنيز المنتج منmarcescenis A1S Serratia له فعالية مضادة لانواع مختلفة من الكائنات ، ويمكن استعماله بديلا للمواد الكميائية في القضاء على مثل هذه الاحياء | Fifteen Serratia isolatesd were obtained from different sources the ability of chitinase production from thes isolates was studied .Semi quantative and quantative screening appeared that Serratia marcescensA1S was the highest chitinase producer . The bacteria was cultured in different liquid and solid state fermentation media(SSF) , different plant sbstanaes were used for (SSF) with or without chitin , while liquid media containet chitin with different nitrogen source By measurements of reducing sugars and N - acetylD - glucosamine it was show this Serratia marcescensA1S produces endochitinase & exochitinase . the activity of exochitinase was higer than that of endochitinase the liquid media gaive higer chitinase production than the (SSF) Serratia marcescensA1S was grow in liquid media under tdifferent condiations and chitinase production was different favorable condtion for chitinase production were inoculation with 2.2 ×104 cell/ ml of bacteria in media containing 2 % chitin with peptone as nitrogen source , at pH 7, and incubated at 30 Cº in shakeing incubater with 150 rpm for 4 days Chitinase production reachet 9.7 unit/mg protein in these condation , Chitinase was precipitated from production media by 75 % saturation of ammonium sulphat with 9 unit/mg protein specific activity , the enzyme obtained from this step was partially purifed with 5.6 fold of purifaction and 80 % recovery . The effect of some facter on enzyme activity and stability were studied ,the optimum PH enzyme activity was 7and the favorites pH for enzyme stability ranged between 6 - 9 , the maximum activity was at 30 Cº, 100 - 65 % of enzyme activity mentained at 30 - 60 C º for 30 min and 57% at 80 Cº. EDTA ,Sodium azide and phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF) have no effect on chitinase activity with 5,10mM . The enzyme was treated with different metal ions , Na+2 increase enzyme activity , since it reached to150 % Mn2+ ,Fe +² ,Ca+2 , K+2, have no effect , while Cu2+, Zn+2, and Hg+2 at 5 Mm decreaced enzyme activity to 31 , 50 , 55 % respectivily and to 25 ، 43 ، 50% when it was treated with 10mM of these ions respectivily . The antibiotic activity of the chitinase against different organisms was determined , the enzyme inhibited Candida albicans growth, aclear zon appeared in the medium cultured with the yeast (treated with enzyme). Many chang appeared on sea snail Achatina fulica treated with enzyme, there was many pores on the shells , and the animal lost its viability . Flour beetle Tribolium confusum died when it was sprayed with chitinase, the chitin layer covered the Insecte body degredated after the treatment . From the above results it can be concluded that chitinase produced from Serratia marcescensA1S has antibiotic activity for different organismes , and it can be used as biocidal compound instead of chemical compounds for destroying or killing the harmful organisms
