Author name:
احمد جمال حسين السرحان
Supervisor name:
فريال جميل عبد عطية
Abstract:
في هذه الدراسة تم جمع 155 عينة شملت العينات السريرية والعينات البيئية من مستشفى الحلة التعليمي . بلغ عدد العينات السريرية 58 عينة عزلت من المرضى الذين يعانون من اصابات الحروق والتهاب المجاري البولية وتجرثم الدم وجمعت العينات البيئية 97 عينة من الاسرة والمطهرات وغرف المرضى في مستشفى الحلة التعليمي من اذار 2016 الى ايار 2016 . شخصت العزلات بالاعتماد على الاختبارات المزرعية والكيموحيوية باستخدام نظام Api 20E فضلا عن تاكيد تشخيصها بوساطة جهاز VITEK 2 . ومن مجموع 155 عينة كانت 30 عزلة عائدة لبكتريا Pseudomonas aeruginosa بنسبة 19.35% . تم التصنيع الخضري لدقائق الفضة النانوية (AgNPs) باستخدام عالق بكتريا P. aeruginosa . كما تمت دراسة صفات دقائق الفضة النانوية باستخدام الاشعة فوق البنفسجية - المرئية الطيفي وحيود الاشعة السينية (XRD) وتشتت طاقة الاشعة السينية (EDX) والاشعة تحت الحمراء الطيفي ( FTIR ) والمجهر الالكتروني الماسح (SEM) . اظهر التحري الجزيئي للسموم الخارجية للبكتريا بوساطة تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل وباستعمال بادئات متخصصة للجينات ( EXO A , EXO T and EXO S )امتلاك جميع العزلات جين للسم الخارجي A والسم الخارجي T بينما اظهرت 22 عزلة نتيجة موجبة للسم الخارجي S. هذه النتائج اشارت الى ان وجود جينات السموم الخارجية هي عوامل ضراوة بارزة لعزلات P. aeruginosa . وتم انتاج السم الخارجي A من بكتريا Pseudomonas aeruginosa في وسط مرق الصويا المديلز وتنقيته باستخدام نسبة اشباع 85٪ من كبريتات الامونيوم ثم بواسطة عمود كروماتوغرافيا السائلة عالية الاداء لانتاج سم عالي النقاوة بعد ذلك تم تحديد الوزن الجزيئي للسم المنقى ليكون 71 كيلو دالتون . تضمنت الدراسة المناعية دراسة الخصائص المستضدية للسم المضعف ودقائق الفضة النانوية والمستضد المختلط المكون من التوكسويد ودقائق الفضة النانوية ثم التحري عن الدورالمناعي لدقائق الفضة النانوية كنظام اعطاء .اذ تمت باستخدام20 ارنب قسمت الى اربعة مجاميع كل مجموعة تضمنت 5 ارانب ,حيث حقنت المجموعة الاولى بالتوكسويد فقط اما المجموعة الثانية فقد حقنت بدقائق الفضة النانوية فقط والمجموعة الثالثة فقد حقنت بالمستضد المختلط ,اما المجموعة الرابعة فحقنت بالمحلول الملحي الفسلجي واعتبرت كسيطرة, وبعد انتهاء مده التمنيع تم التحري عن بعض المعايير المناعية . اظهرت نتائج جميع الفحوصات المناعية المستخدمة في هذه الدراسة ان كل من للسم المضعف ودقائق الفضة النانوية والمستضد المختلط قد اعطت زيادة معنوية بالمقارنة مع مجموعة السيطرة وعلى مستوى احتمالية P<0.05 .فقد اظهرت نتائج اختبار اختزال الصبغة ( NBT ) التي تم الحصول عليها لهذه المستضدات الثلاثة في هذا الاختبار بمعدل(66.8%, 60.6% 73.6% ) على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(46.8%) . وتم استخدام اختبار الجلد حيث اظهرت النتائج ان هذه المستضدات الثلاثة اثرت في تفاعل الحساسية sensitivity للارانب وقد ادت المستضدات المحقونة الى زيادة معنويه في قطر الانتفاخ بعد 4),24,48,(72 ساعة مقارنة مع مجموعه السيطرة على مستوى احتمالية P<0.05. وتم استخدام اختبار معامل الانقسام ايضا والنتائج التي تم الحصول عليها بمعدل(26.96%, 22.8%, 32.11%) على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(13.33%). بالاضافة الى ذلك فقد تم استخدام طريقة الانتشار المناعي لتقدير مستوى الانتشار المناعي للكلوبيولينات المناعية في المصل, واظهرت النتائج بان مستوى الكلوبيولينات المناعية بمعدل (17, 19.8 و19.4 ( ملم على التوالي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة عند P <0.05. وايضا تم استخدام تقنية الامتزاز المناعي المرتبط بالانزيم (ELISA) لتقدير تركيز عناقيد التمايز في المصل CD4 وCD8, وقد كان تركيزCD4 بمعدل (47.49 , 43.82 و63.61 ) نانوغرام/مل على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(26.59) نانوغرام/مل في حين تركيزCD8 بمعدل (2.79 , 3.21و 6.08) نانوغرام\مل بينما مجموعة السيطرة بمعدل (1.6) نانوغرام/مل . وقد اظهرت الدراسة النسيجية بان ليس هنالك افات مرضية في مجاميع الارانب الممنعة بانواع مختلفة من المستضدات . حيث اظهر الكبد ارتشاح للخلايا الالتهابية في المنطقة البوابية والتهاب نقطي في الفصيصات الكبدية في مجموعة السم المضعف ومجموعة المستضد المختلط بينما اظهرت مجموعة دقائق الفضة النانوية ارتشاح للخلايا الالتهابية في المنطقة البوابية فقط . كما اظهر الطحال فرط تنسج للمفاويات في منطقة اللب الابيض لمجاميع الارانب الممنعة . | The study included (155) samples which collected from both clinical and hospital environmental samples. Fifty eight specimens were collected from patients suffering from wounds , urinary tract infections and bacteremia. Ninety seven hospital environmental samples were collected from beds , disinfectants and patient’s rooms at Al - Hilla Teaching Hospital from March 2016 to May 2016. The isolates were identified according to cultural , biochemical test using Api 20 E system and confirmed by VITEK 2 system compact. The results showed that 30/155 (19.35%) gave positive culture for Pseudomonas aeruginosa . The green synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) were prepared using P. aeruginosa suspension . The characterization of silver nanoparticles was carried out using UV - Visible spectroscopy, X Ray diffraction (XRD), Energy Dispersive X - ray Crystallography (EDX), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Scanning electron microscopy (SEM). Genotypic detection of P. aeruginosa exotoxins by polymerase chain reaction was done by using specific primers for exotoxin A, exotoxin T and exotoxin S . All isolates were positive to exotoxin A and exotoxin T whereas (22) isolates gave positive result for exotoxin S gene. These results indicated that the presence of exotoxins genes were prominent virulence factors for P.aeruginosa isolates. Exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa has produced in tryptic soy broth dialysate and purified using 85% saturation of ammonium sulphate then by HPLC column to yield highly purified toxin then molecular weight of purified toxin has determined to be 71 KD . The immunological study involved studying the antigenicity properties of the toxoid alone , AgNPs alone and mix antigen then investigating the immunological role of AgNPs as delivery system. It was done by using 20 males New Zealand rabbits and divided into four groups, the first group was immunized with toxoid alone, the second group was immunized with AgNPs alone , the third group was immunized with mix antigen , while the fourth group considered as control group and immunized with normal saline, after the immunization period, some immunological parameters were investigated. In all immunological tests of this study the results revealed that toxoid alone , AgNPs alone and mix antigen were given significantly increased in comparison with control group at P<0.05 . For NBT test , the result that was obtained for these three types of antigens with mean value (66.8%, 60.6% and 73.6%) respectively ,while the control group with mean value (46.8%) . The results of skin test showed these three types of antigens induce the hypersensitivity of the rabbits and the induration diameter of these three types antigen after 4, 24, 48 and 72 hrs. was significantly higher than control at P<0.05. Also , mitotic index test also was used , the result that was obtained for these three types of antigens with mean value (26.96%, 22.8% and 32.11%) respectively ,while the control group with mean value (13.33%) . In addition, the radial immunodiffusion (RID) method was used to detect the immunodiffusion level of the immunoglobulins in serum samples, the results showed that the immunodiffusion level of immunoglobulins with mean values (17, 19.8 and 19.4) mm respectively, in comparison with control group at P<0.05 . The concentration level of the CD4 and CD8 in the serum samples was determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method, the concentration level of CD4 molecule with mean values (47.49, 43.82 and 63.61) ng/ml respectively while the control group with mean value (26.59) ng/ml. And the CD8 molecule with mean values (2.79, 3.21 and 6.08) ng/ml respectively, while the control group with mean value (1.6) ng/ml . Histopathological study showed that there were no pathological lesions in rabbits groups immunized with different types of antigens . The liver showed inflammatory cells infiltration in the portal area and spotty lobular inflammation in toxoid alone and mix antigen groups whereas in AgNPs alone group showed only inflammatory cells infiltration in the portal area . The spleen showed reactive germinal center in white pulp for toxoid alone , AgNPs alone and mix antigen groups
