Author name:
ايمان جواد كاظم
Abstract:
تضمنت الدراسة تاثيرات الاانزيمات المحللة للبروتين ( Proteases) المنتجة من بكتريا Pseudomonas aeruginosa المعزولة من التهاب القرنية القيحي والجروح, حيث جمعت (200) عينة شملت (150) عينة من مسحات العيون المصابة بالتهاب القرنية و(50) عينة من مسحات الجروح المختلفة. وقد تم الحصول على 17 (%8.5) عزلة بكتيرية من هذه المسحات تعود للنوع P. aeruginosa . وقد تم تشخيص العزلات بوساطة الاختبارات الكيموحيوية. ( 13 عزلة بكتيرية (% 8.7) من التهاب القرنية, و4 عزلات بكتيرية (%8) من الجروح). اظهرت نتائج الكشف عن قابلية البكتريا على انتاج انزيمات البروتيزات, ان 13 عزلة بكتيرية (76.5) كانت منتجة لانزيم Elastase ( 10 عزلة بكتيرية (%76.9) من التهاب القرنية و3 عزلة بكتيرية (%75) من الجروح ), ولوحظ ان العزلتين البكتيريتين P7 , وP11 من التهاب القرنية, وP2من الجروح اعطت اكبر منطقة تحلل 8, 10, 10) مليمتر (على التوالي. كما بينت النتائج ان الكشف النوعي عن قابلية العزلات البكتيرية P. aeruginosa على انتاج انزيم البروتيز القاعدي باستعمال وسط اغار الحليب المقشود (Skim milk agar) اظهر ان العزلات البكتيرية المعزولة جميعها من مرضى التهاب القرنية ومسحات الجروح لها القابلية على انتاجه, كانت العزلة البكتيرية P12 المعزولة من التهاب القرنية الافضل حيث اعطت اكبر منطقة تحلل 22) مليمترا( . في حين ان نتائج الكشف عن قابلية هذه العزلات البكتيرية على انتاج هذا الانزيم باستعمال وسط مرق الكازئين (Casein broth) , بينت ان العزلات البكتيرية المعزولة جميعها من مرضى التهاب القرنية كانت ذات فعالية انزيمية وكانت العزلة البكتيرية P12 هي الافضل من حيث الفعالية الانزيمية اذ بلغت الفعالية النوعية للانزيم 97.469) وحدة / مليغرام( . بينما اظهرت %50 من العزلات البكتيرية المعزولة من الجروح فعالية انزيمية. اشارت نتائج قابلية العزلات البكتيرية على انتاج انزيم LasA الى ان العزلات البكتيرية المعزولة جميعها من التهاب القرنية ومن الجروح لها القابلية على انتاج الانزيم, واظهرت العزلة البكتيرية P6 المعزولة من التهاب القرنية اعلى فعالية اذ بلغت 25.94) وحدة / مليغرام (. اما نتائج الكشف عن قابلية العزلات البكتيرية على انتاج انزيم LasD فقد اظهرت ان 8 عزلات بكتيرية (% 61.5) من العزلات البكتيرية المعزولة من التهاب القرنية ذات فعالية انزيمية بلغت ذروتها في العزلة البكتيرية P11 100.465) وحدة / مليغرام ( . و3 عزلات بكتيرية (%75) من العزلات البكتيرية المعزولة من الجروح اعطت فعالية لهذا الانزيم ولكن واطئة جدا تراوحت ما بين 8.797 - 5.557) وحدة / مليغرام(.استخلص انزيمي البروتيز القاعدي ( من العزلة البكتيرية P12 ) وLasA ( من العزلة البكتيرية P6 ) بوساطة النبذ المركزي المبرد للمزروع البكتيري وتمت تنقيتهما جزئيا باستعمال الترسيب بكبريتات الامونيوم (بنسبة اشباع % 80 ) وكروماتوغرافيا التبادل الايوني باستخدام عمود DEAE - Cellulose , حيث ازدادت الفعالية النوعية للانزيمين وبلغت ( 1629.62 وحدة / مليغرام) لانزيم البروتيز القاعدي و( 718.651وحدة / مليغرام ) لانزيم LasA . درس تاثير هذين الانزيمين المنقيين جزئيا في قرنيات عيون الارانب (in vivu) كلا على حدة وبتراكيز مختلفة ( 10, 7, 5) وحدة / مليلتر ( للبروتيز القاعدي و5, 3, 1) وحدة / مليلتر (لانزيم LasA ) حيث اشارت النتائج الى وجود تا ثيرات واضحة لهما في قرنيات عيون الارانب حيث سبب انزيم البروتيز القاعدي عتمة من الدرجة الثالثة ) عتمة في ثلثي الى كل سطح القرنية و/ او انتفاخ متوسط (. اما انزيم LasA فقد سبب عتمة من الدرجة الثانية ) عتمة في ثلثي سطح القرنية و/او انتفاخ طفيف ( . كما درس تاثير هذين الانزيمين في مستخلص البروتينات لقرنيات عيـون الارانب (in vitro) باستعمال الترحيل الكهربائي بهلام متعدد الاكريل امايد, واظهرت النتائج حدوث تحلل وتمسخ تام لحزم بروتينات القرنية وعند الفعالية الانزيمية 10, 7, 5 ) وحدة / مليلتر( لانزيم البروتيز القاعدي وعند الفعالية الانزيمية 5, 3, 1 ) وحدة / مليلتر( لانزيم Las A. | The study is included the effects of proteases enzymes producing by Pseudomonas aeruginosa, which isolated from keratitis and wounds .two hundred samples were collected, 150 samples of them were keratitis and fifity samples were wounds.Seventeen isolates (8.5 %) were obtained and diagnosed as P. aeruginosa.13 isolates (8.7%) from keratitis and 4 isolates (8%) from wound swabs. All bacterial isolates were diagnosed by biochemical tests. The production of elastase were tested by using elastin agar.Thirteen isolates (76.5%) had the ability to producing elastase (10 isolates (76.9 %) from keratitis and 3 isolates (75%) from wounds). The isolates P7 and P11from keratitis and P2 from wounds had the larger hydrolysis Zone ( 10, 10, 8 millimetre ) respectively.The production of alkaline protease were tested by using solid cultures ( skim milk agar ), all of them (keratitis and wound swabs ) had the ability to production of the enzyme, the isolates P12 isolated from keratitis had the larger hydrolysis zone ( 22 millimetre). Also the production of the enzyme were tested in liquid cultures ( casein broth ), all isolates from keratitis had the ability to production of the enzyme, the isolates P12 had the specific activity 97.469 U / mg, while 50 % of the wounds isolates had the ability to producing alkaline protease. The production of LasA enzyme were tested, all isolates (keratitis and wound swabs ) had the ability to production of the enzyme, the isolates P6 isolated from keratitis had higher specific activity 25.94 U / mg.The production of LasD enzyme were tested,8 isolates (61.5 %) from keratitis isolates had the ability to producing LasD enzyme. The isolate P11 had higher specific activity 100.465 U / mg, while 3 isolates (75 %) from wounds isolates had lower ability to producing LasD enzyme including between ( 5.557 - 8.747 U / mg). The alkaline protease was extracted from P12 isolate and LasA enzyme was extracted from P6 isolate. The enzymes were extracted by cooling centrifuge and them purified partially by precipitation with ammonium sulphate ( 80 % ) and ion exchange chromatography by DEAE - Cellulose the specific activity for enzymes were increased,which reached and 1629.62 U / mg for alkaline protease enzyme and 718.651 U / mg for LasA enzyme. The results of the enjection of alkaline protease and LasA enzyme in eyes corneal rabbits (in vivu) showed that both enzymes had the obvious effect on the cornea. The alkaline protease (5, 7, 10 U / ml ) caused damage for the cornea grade III melting ( two - thirds to all of the corneal surface ) and / or moderate bulging. Also the LasA enzyme ( 1, 3, 5 U / ml ) caused damage for the cornea grade II melting ( one - thirds to two - thirds of the corneal surface) and / or mild bulging.The protein profile of extract corneal proteins treated with alkaline protease ( 5, 7, 10 unit / ml) and LasA enzyme ( 1, 3, 5 unit / ml) (in vitro) by polyacrylamide gel electrophoresis showed hydrolysis and complete denaturation of corneal proteins bands.
