Author name:
ضحى ميسر مجيد
Supervisor name:
اياد وجيه الشهواني | Allah Bakhsh
Key words:
- EPSPS
- Cloning
- potato (Solanum tuberosum L.)
- glyphosate herbicide
Abstract:
Summary This study aimed to develop an efficient tissue culture and genetic transformation protocol for two potato cultivars, Riviera and Almonda, with the goal of conferring resistance to glyphosate herbicide through the introduction of the 5-EnolPyruvylShikimate-3-Phosphate Synthase (EPSPS) gene using Agrobacterium tumefacient-mediated transformation. Comprehensive experiments were conducted to evaluate the regeneration ability, transformation efficiency, and gene expression of both cultivars. Callus induction was achieved from both leaf and internodal explants on Murashige and Skoog's medium (MS) supplemented with different combinations of plant growth regulators (PGRs). The highest percentage of callus induction was obtained from the internodal explants of Riviera cultivar at 100% in callus induction media I (CIM I) supplemented with 2 mg/L Benzyl Adenine (BA), 0.2 mg/L α-Naphthalene Acetic Acid (NAA), 2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), 0.2 mg/L Kinetin (Kin) and 0.2 mg/L gibberellic acid (GA3), followed by Almonda with a maximum of 96.3% of leaf explants in callus induction media II (CIM II). Riviera cultivar consistently showed superior morphogenic responses in terms of callus induction, shoot regeneration, and root formation when compared to Almonda. Shoot induction was significantly higher in Riviera leaf explants, reaching 33.3% on shoot induction media II (SIM II) supplemented with 2 mg/L BA, 0.2 mg/L NAA, 0.5 mg/L Kin and 0.2 mg/L GA3, while Almonda showed negligible shoot induction. Following regeneration, both cultivars showed 100% root induction on root induction medium (RIM), indicating the effectiveness of the root induction medium and the overall reliability of tissue culture protocol. After infection with Agrobacterium tumefaciens (LBA4404 Agrobacterium strain) harboring recombinant plasmid that contained 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSPS) gene, callus induction from leaf and internodal explants from both cultivars were successfully observed on callus induction medium-I and II (CIM-I and CIM-II) within four weeks. Riviera explants responded strongly, with callus induction rate reaching 91.67% in internodal explants on CIM-II, compared to a maximum rate of 81.43% in Almonda cultivar under the same condition. Shoot induction also followed a similar trend. Riviera achieved shoot formation rates of 56.78% from leaf explants and 30.91% from internodal explants, while Almonda recorded significantly lower values, not exceeding 1.76%, showing its limited morphogenic capacity under the tested transformation conditions. Polymerase chain reaction (PCR) analysis confirmed the integration of EPSPS gene in regenerated Riviera cultivar, with no amplification seen in Almonda cultivar, suggesting a genotype-dependent transformation efficiency. Real-time PCR analysis further confirmed the high expression levels of gene in Riviera cultivar, showing approximately nine folds when compared to the non-transformed control plants. In contrast, Almonda showed no detectable gene expression, may be due to physiological resistance, tissue incompatibility, or failure to regenerate from transformed cells. Herbicide resistance (Glyphosate/ Roundup Ready), assays proved that transgenic Riviera line could survive glyphosate application (4.11 g/L), with only mild symptoms of stress such as temporary chlorosis, while control and with non-transformed plants suffered from severe chlorosis, necrosis, and death. This confirms not only the stable integration and expression of the EPSPS gene but also its functional role in conferring glyphosate resistance. In conclusion, the Riviera cultivar proved to be highly responsive to both tissue culture conditions and genetic transformation, making it a promising candidate for the development of herbicide-resistant potato lines. Meanwhile, Almonda exhibited limited transformation potential, emphasizing the need for genotype-specific optimization in future studies. The findings from this study offer critical insights into the establishment of effective protocol for potato production, which are indispensable tools advancing genetic engineering and breeding programs. الخلاصة هدفت هذه الدراسة الى تطوير بروتوكول فعال لزراعة الانسجة والتحول الوراثي لصنفين من البطاطا، ريفيرا (Riviera) والموندا (Almonda)، بهدف اكسابهما مقاومة لمبيد الاعشاب الغلايفوسبت (glyphosate)، من خلال ادخال جين 5-اينول بايروفيل شكميت -3- فوسفيت سنثيز(EPSPS) باستخدام التحول الوراثي بواسطة Agrobacterium tumefaciens. وقد اجريت تجارب شاملة لتقييم القدرة على التجديد الحيوي، وكفاءة التحول الوراثي، ومستوى تعبير الجين في كلا الصنفين. تم تحفيز تكوين الكالس من اجزاء الاوراق والعقل الساقية على وسط Murashige and Skoogs (MS) المدعم بتراكيب مختلفة من منظمات النمو النباتية. وقد سجل صنف ريفيرا اعلى نسبة استحثاث الكالس من العقل الساقية بنسبة 100% على وسط تحفيز الكالس الاول (CIM I) المدعم ب 2 ملجم/لتر بنزيل ادينين (AB)، 0.2 ملجم/لتر من حامض النفثالين اسيتيك (NAA)، 2 ملجم/لتر من حامض 2،4-ثنائي كلوروفينوكسي اسيتيك (2,4-D)، 0.2 ملجم/لتر من الكينيتين (Kin)، و0.2 ملجم/لتر من حامض الجبرلين (GA3)، تلاه صنف الموندا بنسبة قصوى بلغت 96.3% من اوراقه على وسط تحفيز الكالس الثاني (CIM II). وقد اظهر صنف ريفيرا استجابات مورفولوجينية افضل من الموندا فيما يتعلق بالكالس وتكوين البراعم والجذور. اما استحثات البراعم فكان اعلى في الاوراق بنسبة 33.3 على وسط SIM II، في حين كانت الاستجابة شبه معدومة في الموندا. وبعد التجديد، حقق كلا الصنفين نسبة جذور بلغت 100، مما يدل على كفاءة وسط التجذير وفعالية البروتوكول المعتمد. بعد اصابة الاجزاء النباتية ببكتريا Agrobacterium tumefaciens (السلالة (LBA4404 الحاملة لبلازميد معدل يحتوي على جين (EPSPS)، تم رصد تكوين الكالس بنجاح على وسط تحفيز الكالس الاول والثاني (CIM-I وCIM-II) خلال اربعة اسابيع. اظهرت الاجزاء النباتية من ريفيرا استجابة قوية، حيث بلغت نسبة الاستحثاث 91.67% في العقل الساقية على CIM-II، مقارنة بـ 81.43% كحد اقصى في الموندا تحت نفس الظروف. كما اظهرت استحثاثات البراعم نمطا مشابها، اذ بلغت 56.78% من اوراق صنف ريفيرا و30.91% من العقل الساقية، في حين لم تتجاوز نسب الاستحثاث في الموندا 1.76%، مما يبرز ضعف قدرته المورفوجينية في ظروف التحول المستخدمة. اكد تحليل تفاعل البوليميراز المستلسل (PCR) دمج جين EPSPS في نباتات ريفيرا المتجددة، في حين لم يلاحظ اي تضخيم في نباتات الموندا، مما يشير الى كفاءة تحول وراثي تعتمد على الصنف. كما اكدت تحاليل Real-time PCR ارتفاع مستويات تعبير الجين في صنف ريفيرا بما يعادل تسعة اضعاف مقارنة بالنباتات غير المحورة. بينما لم يرصد اي تعبير للجين في الموندا، مما قد يعزى الى مقاومة فسيولوجية، او عدم ملائمة الانسجة، او فشل الخلايا المحورة في اكمال مسار التجديد النباتي. اظهرت اختبارات مقاومة الغلايفوسيت (Glyphosate/ Roundup Ready)، ان النباتات المحورة من صنف ريفيرا استطاعت البقاء بعد المعاملة بتركيز 4.11 غم/لتر، مع ظهور اعراض بسيطة مثل الاصفرار وذبول شديد، في حين اظهرت النباتات غير المحورة اعراض الاصفرار زنخر شديدين ادت الى موتها. مما يدل على تكامل واستقرار تعبير الجين ووظيفته الفعالة في منح المقاومة للمبيد. ختاما، اثبت صنف ريفيرا كفاءته العالية في الاستجابة لكل من زراعة الانسجة والتحول الوراثي، مما يجعله مرشحا واعدا لتطوير خطوط بطاطا مقاومة لمبيدات الاعشاب. بينما اظهر صنف الموندا الموندا قدرة محدودة على التحول، مما يؤكد ضرورة تكييف البروتوكولات وفقا للتركيب الوراثي لكل صنف. وتشكل نتائج هذه الدراسة اساسا قويا لتطوير برامج تربية بطاطا متقدمة باستخدام الهندسة الوراثية.
