Author name:
سيناء مهدي شاكر الخفاجي
Supervisor name:
رجوة حسن عيسى الربيعي
Abstract:
• عزلت 34 عزلة بكتيرية تعود للنوع Acinetobacter baumannii من بين 424 عينة شملت عينات ( جروح ، ادرار ، قشع ، دم ) وبنسبة 8.01% جمعت من المرضى الراقدين في مستشفى بغداد التعليمي / مدينة الطب ، وقد شخصت من خلال الصفات الزرعية (المستعمرات) والمجهرية ( البكتريا) والاختبارات الكيميائية الحياتية وباستخدام نظام Api 20 E ، وقد كانت معدلات الاصابة ببكتريا Acinetobacter baumannii في العينات المشخصة (جروح ، ادرار ، قشع ، دم ) هي (15 ، 11، 6 ، 2) % على التوالي .• التحري عن عزلة كفوءة منتجة للكبسولة ، اذ امكن الحصول على عزلة كفوءة منتجة للكبسولة عند تنمية العزلات في وسط اغار نقيع القلب والدماغ المضاف اليه 5% كلوكوز وبفترة حضن 5ايام ودرجة حرارة 30 م.• التحري عن حساسية عزلات بكتريا Acinetobacter baumannii تجاه 19 مضادا للحياة ، وقد اظهرت العزلات البكتيرية حساسية بنسبة 100% للمضاد Imipenem ومقاومة بنسبة 100% لمضادات الحياة (Cotrimoxazol , Nitrofurantoin , Carbenicillin , Cephalothin , Tetracyclin , Aztreonam , Ciprofloxacin ) • حددت التراكيز المثبطة الدنيا لـ 8 مضادات للحياة Ciprofloxacin وGentamicin وAmikacin وTobramycin وCefotaxime وPipracillin وPiracillin +Tazobactum وCefepime واظهرت النتائج ان هنالك اختلافا واضحا في الـMIC لهذه المضادات ،اذ تراو حت قيم الـMIC لهذه المضادات (4 - 512 ، 8 - 1024< ،4 - 256 ، 4 - 1024< ، 16 - 1024< ، 8 - 256 ، 8 - 512) مكغم /مل على التوالي .• التحري عن قابلية عزلات Acinetobacter على ازالة لون اغار الدم الحاوي على السكريات ، اذ اظهرت العزلات البكتيرية قابليتها على ازالة لون اغار الدم الحاوي على السكريات نوع الدوز Aldose وتغييره الى لون بني .• التحري عن قابلية 18 عزلة بكتيرية منتخبة بصورة عشوائية تعود للنوع Acinetobacter baumannii على تلزين كريات الدم الحمر للانسان وباصنافه الاربعة A , B, AB, O في اطباق المعايرة الدقيقة Microtitration plates ، وقد بينت النتائج قابلية العزلات المنتخبة جميعا على تلزين كريات الدم الحمر للانسان للاصناف A , B AB, فيما اخفقت العزلات المنتخبة جميعا على تلزين كريات الدم الحمر للانسان للصنف O .ثانيا - الجانب المناعي : استهدف هذا الجانب استخلاص الكبسولة من العزلة الكفوءة ودراسة تاثير تراكيز مختلـفة (25 ، 50 ، 100 ، 150 ، 250 ، 500) مكغم /مل من مستخلص الكبسولة على الخلايا المناعية باختيار المعايير الاتية : عيوشية الخلايا متعددة اشكال النوى والخلايا اللمفاوية ، التشكل الزهري التائي والبائي ، عملية البلعمة ، اختزال صبغة النايتروبلوتترازوليم ، معامل انقسام خلايا نخاع العظم في الفئران والتحري عن الاضداد المتخصصة بمستخلص الكبسولة باجراء اختبار اخترلوني . ومنها تم الحصول على النتائج الاتية : • عدم تاثير التراكيز (25 ، 50 ، 100) مكغم /مل من مستخلص الكبسولة على عيوشية الخلايا متعددة اشكال النوى والخلايا اللمفاوية ، فيما اظهرت التراكيز (150 ، 250 ، 500) مكغم /مل تاثيرا على عيوشية الخلايا متعددة اشكال النوى والخلايا اللمفاوية .فقد سببت انخفاضا في عيوشية هذه الخلايا .• انخفاض النسبة المئوية للخلايا اللمفاوية التائية المكونة للتشكل الزهري الفعال والكلي نتيجة لتاثير تراكيز مستخلص الكبسولة (100 ، 150 ، 250 ، 500) مكغم /مل على الخلايا التائية.• انخفاض النسبة المئوية للخلايا اللمفاوية البائية المكونة للتشكل الزهري نتيجة لتاثير تراكيز مستخلص الكبسولة (100 ، 150 ، 250 ، 500) مكغم /مل.• اظهرت النتائج زيادة في عملية البلعمة عند استخدام التركيز 100 مكغم /مل من مستخلص الكبسولة فيما انخفضت عملية البلعمة عند استخدام التراكيز (150 ، 250 ، 500) مكغم /مل من مستخلص الكبسولة .• انخفاض في النسب المئوية للخلايا المكونة للفورمازان باستخدام التراكيز (100 ، 250 ، 500) مكغم /مل من مستخلص الكبسولة .• انخفاض في معامل الانقسام الخيطي لخلايا نخاع العظم في الفئران باستـــخدام التركيزيـــن (100 ، 250) مكغم /مل من مستخلص الكبسولة .• تكون خطوط ترسيب بين مستخلص الكبسولة ومصول الارانب الممنعة به باستخدام المصل بدون تخفيف وعند تخفيفه بنسبة 1 : 10 ، فيما لم تظهر اي خطوط ترسيب عند استخدام التخفيفين 1 : 100 و1 : 1000 او عند استخدام المصل قبل التمنيع .ثالثا - الالتصاق البكتيري وتثبيط الالتصاق البكتيري : تضمن هذا الاختبار مقارنة التصاق عزلات مكونة للكبسولة وغير مكونة للكبسولة على البولستايرين ومقارنة التصاق عزلة مكونة للكبسولة وعزلة غير مكونة للكبسولة بالخلايا الطلائية المعزولة من ادرار الانسان لمعرفة دور الكبسولة في الالتصاق ، فضلا عن تثبيط الالتصاق البكتيري باستخدام : ا - اضداد مستخلص الكبسولة Capsular antibodies ،اذ تم الحصول على مضاد الكبسولة بعد تمنيع الارانب بمستخلص الكبسولة ومفاعلة المصل المضاد للكبسولة مع عزلة مكونة للكبسولة وعزلة غير مكونة للكبسولة لبكتريا Acinetobacter baumannii ومن ثم اجراء اختبار الالتصاق البكتيري لمعرفة دور اضداد الكبسولة في تثبيط الالتصاق .ب - ماتحت التركيز المثبط الادنى subMIC من خلال تنمية العزلة المكونة للكبسولة في وسط نقيع القلب والدماغ السائل BHIB الحاوي على تركيز الـ subMIC لبعض المضادات البكتيرية ، واجري اختبار الالتصاق البكتيري ومقارنة ذلك بمعدل نفس العزلة المنماة في نفس الوسط الخالي من الـ subMIC لمعرفة تاثير الـsubMIC في عملية تخليق الكبسولة وعملية الالتصاق البكتيري .• اظهرت نتائج اختبار الالتصاق على البولستايرين قابلية العزلتين المكونتين للكبسولة على البقاء ملتصقة على البولستايرين فيما اخفقت العزلتين غير المكونتين للكبسولة بالبقاء ملتصقتين على البولستايرين .• بلغ معدل التصاق البكتريا المكونة للكبسولة بالخلايا الطلائية للانسان (35.62) وبذلك هو اعلى من معدل التصاق البكتريا غير المكونة للكبسولة (19.68) .• اظهرت الاضداد المتخصصة للكبسولة تاثيرا مثبطا لالتصاق العزلة المكونة للكبسولة ، فيما لم تؤثر في التصاق العزلة غير المكونة للكبسولة .• ادى ما تحت التركيز المثبط الادنــــى subMIC للمضاديــــن Ciprofloxacin 64 مكغم/مل وPiracillin + Tazobactum 16 مكغم /مل الى تثبيط الالتصاق البكتيري ، اما في حالة المضادين Cefotaxime 1024 مكغم /مل وGentamicin 4 مكغم /مل فلم يكن هنالك تاثيرا في عملية الالتصاق اذ كان الالتصاق طبيعيا اي انه لم يكن له تاثير ايضا في عملية تخليق الكبسولة .رابعا - الدراسة النسيجية : درست التغييرات النسيجية المختلفة في الفئران المحقونة بالعالق البكتيري Acinetobacter baumannii ومستخلص الكبسولة في الاعضاء ( الكبد ، الطحال ، الكلية ، الرئة ، الامعاء ) ، اذ ظهر تاثير للعالق البكتيري ومستخلص الكبسولة في كل الاعضاء وقد لوحظ تاثير العالق البكتيري في الكبد بوجود خثارات كثيرة داخل الكبد مع وجود تغير دهني ووجود قطيرات دهنية داخل نسيج الكبد ، والطحال ظهر فيه تضخم باللب الابيض في منطقة الخلايا البائية ومنطقة الخلايا التائية ، اما الرئة فقد وجد فيها احتقان مع انخماس ، وظهر في الكلية توسع بسيط في محفظة بومان مع وجود قطيرات دهنية او تغير دهني داخل الكبيبات ووجود تنكس استسقائي في بعض النبيبات ، وفي الامعاء ظهر تضخم في لطخ باير وتنكس مخاطيني . اما تاثير مستخلص الكبسولة فقد ظهر في الكبد بوجود خثرة داخل اوردة الكبد مع توسع في الجيبانيات ، وفي الرئة ظهر ارتشاح خلايا التهابية حول الاوعية الدموية ووجود خلايا التهابية حول القصبات ، اما في الكلية يلاحظ تغيير دهني في الكبيبات ، وظهر في الطحال تكوين دم خارج النخاع مع وجود فرط تنسج في اللب الابيض ، وظهر في الامعاء تضخم لطخ باير مع وجود تنكس مخاطيني . | Acinetobacter baumannii was isolated from 424 samples from wound , urine , sputum , and blood , which were collected from Baghdad hospital / Medical city, 34 isolates (8.01 %) of Acinetobacter baumannii was identified depending on the morphological , cultural ,and biochemical characteristics , by Api 20 E system. The infection rate by Acinetobacter baumannii identified samples (wound , urine , sputum , and blood ) were (15 , 11, 6, 2) % respectively .Detection the efficiency of isolate to produce a large capsular polysaccharide . Under incubation period 5 days at 30 C º and cultural media (Brain heart infusion agar + 5 % glucose) for production of a large amount of capsular polysaccharide . The susceptibility of Acinetobacter baumannii isolates to 19 antibiotics were performed . All isolates were susceptible 100% to imipeneme and resistant 100% to (Cotrimoxazol , Nitrofurantoin , Carbenicillin, Tetracycline , Aztreonam , Ciprofloxacin , Cephalothin Minimum inhibitory concentration ( MIC) of 8 antibiotics (Ciprofloxacin , Gentamicin , Tobramycin , Amikacin , Cefotaxime , Pipracillin , Pipracillin + Tazobactum , Cefipeme ) were determined , which they were ( 4 - 512 , 8 - >1024 , 4 - >1024 , 4 - 256 , 16 - >1024 , 8 - 256 , 8 - 512) μg /ml respectively . The ability of Acinetobacter isolates to discolored blood agar that containing sugars was detected .All isolates showed their ability to discolored blood agar that containing sugars only from type aldose. Ability of isolates that chosen randomly to agglutinate red blood cells of human A,B,AB,O blood groups in micro titration plates was done . Results showed the ability of the isolates to agglutinate red blood cells groups A,B,AB only but not blood group O . Second : Immunological aspect : Extraction of capsular polysaccharide from the efficient isolate number (26) had been done . Then the effect of different concentrations( 52, 50 ,100, 150 , 250 , 500) μg/ml of capsular extract on immune cells were studied according to following parameters : Viability of polymorph nuclear leukocytes and lymphocytes , T&B lymphocytes rosette formation , phagocytosis in vitro, reduction of nitroblutetrazolium , mitotic index test for bone marrow cells in mice , and investigation about specific capsular antibodies by ochterlony test. All these immunological tests were done , the following Results were : No effect was found of concentrations (25,50,100) μg/ml of capsule extract on viability of polymorph nuclear cells & lymphocytes , while concentrations (150, 250 , 500) μg/ml decreased it .The concentrations (100,150,250,500) μg/ml of capsular extract decreased the percentage of T&B rosette formation . Hundred μg/ml of capsular extract increase phagocytic index , while (150, 250, 500) μg/ml inhibited it . Capsular extract concentrations (100, 250, 500) μg/ml decreased number of cells producing Formosan , and (100, 250) μg/ml of capsular extract decreased mitotic index in mice. Precipitation lines were found between capsular extract and serum of immunized rabbits without dilution and with the dilution 1 : 10 .Third : Bacterial adherence and inhibition bacterial adherence : Comparison the adherence between encapsulated isolates and non encapsulated isolates on polystyrene and comparison the adherence between capsulated isolate and non encapsulated isolate on epithelial cells which took from urine to know the capsular role in adherence , and inhibit the bacterial adherence by using : 1 - capsular antibodies which were obtained after immunized the rabbits with capsular extract ,then reaction of the serum with encapsulated and non encapsulated isolates and after that the adherence test was done .2 - sub minimum inhibitory concentration (SubMIC) after growing encapsulated isolate in brain heart infusion broth containing subMIC of some antibiotics and the test of bacterial adherence was done and comparison between the same isolate growing in brain heart infusion broth with subMIC and without subMIC to find the role of subMIC in capsule production process . Results of adherence test on polystyrene showed the ability of encapsulated isolates to adhere on polystyrene while non encapsulated isolates washedout . The rate of encapsulated isolate adhere on human epithelial cells was 35.62 , and that was higher than the rate of non encapsulated isolate which was 19.68. Specific capsular antibodies inhibit adherence of encapsulated isolate, while it had no effect on non encapsulated isolate adherence . SubMIC of the antibiotics ciprofloxacin and piracillin+tazobactum had an inhibitory effect on encapsulated isolate adherence , while their was no effect when subMIC of antibiotic cefotaxime and gentamicin was used. Fourth : Histological aspect : Different histological changes in mice after injected with bacterial suspension and capsular extract were studied in organs (liver , spleen, kidney, lung, intestine) . The effect of bacterial suspension and capsular extract was noticed in all the studied organs . The effect of bacterial suspension in liver was noticed by many clotting inside the liver with fatty changes in the liver tissue , in spleen increased in white pulp size in the region of T&B cells , in lung congestion , in kidney enlargement in bowman capsule with fatty changes inside tubules with hydrobic degeneration in many tubules , in intestine enlargement in payers patches and mucosal degeneration . The effect of capsular extract was noticed in liver by the appearance of clot inside liver’s veins with enlargement in sinuses , in lung infiltration of inflammatory cells around the blood vessels with inflammatory cells around tracheas , in kidney fatty changes in glomerulus . in spleen , blood formation out of the marrow with reactive hyperplasia , in intestine enlargement in payer patches with mucosal degeneration
