Author name:
رغد ضياء عبد الجليل الشيباني
Supervisor name:
عبد العزيز مجيد الكبيسي | ناهي يوسف ياسين
Abstract:
تم فصل 32 مركبا مختلفا من المستخلصات الخام المختلفة للاوراق ، و28 مركبا من المستخلصات الخام المختلفة للسيقان ، و36 مركبا من المستخلصات الخام المختلفة للازهار اي بحصيلة اجمالي 96 مركب . تم تمييز قسم من هذه المركبات المفصولة بمقارنتها بمركبات قياسية معروفة ، في حين بقي القسم الاخر منها مجهولا ، والمركبات المشخصة هي : Oleandrin ، Nerigoside ، Glucosylnerigoside، Odorside A ، Oleaside E ، Olaside A ، Adynerin . واختلف وجود هذه المركبات اعتمادا على نوع المستخلص وجزء النبات المستخدم في الاستخلاص .وفي تجارب تاثير المستخلصات الخام ومركب الاولندرين النقي على الوراثة الخلوية للخلايا اللمفاوية لدم الانسان فقد وجد ان التركيز غير السام خلويا من المستخلص المثيلي هو0.01µg/ml عند الحضن لمدة 1 ، 48 و72 ساعة على التوالي . وقد ادت جميع التراكيز الاعلى منها الى انخفاض معنوي في قيمة معامل الانقسام الخيطي Mitotic Index (MI)ومعامل التحول الارومي Blast Index (BI) وادت التراكيز الادنى الى زيادة معنوية في قيمة MI وBI وهذه الظاهرة تسمى الـ Hormetic effect التي ظهرت في هذا المستخلص بشكل واضح . ولمستخلص الاسيتونايترايل والمثلين كلورايد فقد كانت التراكيز غير السامة خلويا 0.1µg/ml، 1µg/mlو0.01 µg/ml عند الحضن لمدة حضن 1 ، 48 ساعة . وقد ادت جميع التراكيز الاعلى منها الى انخفاض معنوي في قيمة MIو BI . اما المستخلص المائي فقد كانت التراكيز غير السامة خلويا هي 1µg/mlو 0.1µg/ml و0.01µg/ml والتراكيز الادنى منها ولفترات الحضن ( 1، 48 ، 72 ) ساعة على التوالى ، وادت جميع التراكيز الاعلى منها الى انخفاض معنوي في قيمة MI وBI. ولوحظت ظاهرة الـ Hormetic effect ايضا عند التراكيز المختلفة من مركب الاولندرين لمدة ساعة واحدة مع الخلايا ، اذ ادت التراكيز العالية الى انخفاض معنوي في كل من MI وBIفي حين ادى التركيز الواطيء الى زيادتها ولو بشكل غير معنوي ، كانت التراكيز غير السامة هي 5ng/ml والتراكيز الادنى منها وعند زيادة فترة الحضن لمدة 48 ،72 ساعة فقد كانت جميع التراكيز المستخدمة سامة خلويا. وتم استخدام المستخلصات الخام والاولندرين باضافتها بدلا من المادة المشطرة PHA واظهرت النتائج عدم وجود اي تحفيز لانقسام الخلايا اللمفاوية وللتراكيز المستخدمة جميعها. كما تم استخدام المستخلصات الخام والاولندرين باضافتها بدلا من مادة الكولجسين ونتج عن ذلك وجود انقسام خلوي متوقف عند الطور الاستوائي metaphase وبفارق معنوي لكل من دليل الانقسام الخلوي ومعامل التحول الارومي .وجد تاثير ايجابي للمستخلص المثيلي الخام على دورة الخلية وتقدمها ولجميع التراكيز المستخدمة في التجربة ولمدة ( 1 ، 48 ) ساعة . وازدادت ايضا قيم Replicative Index (RI) دون ان يؤثر ذلك على تركيب الكروموسوم اذ لم تظهر استخدام التركيزين الوسطي والعالي اي فروق معنوية في Sister Chromatid Exchange (SCE) بالمقارنة مع السيطرة ، بينما ادى التركيز الواطيء الى انخفاض SCE وبنسبة تثبيط بلغت 6.67 % لمدتي تعريض ( 1 ، 48 ) ساعة. وظهر تاثير Hormetic effect بشكل واضح عند اطالة فترة المعاملة لمدة 72 ساعة اذ اختفت التاثيرات الايجابية على دورة توالي الخلية CCP وانخفضت قيم RI وازدادتSCE عند استخدام التركيز العالي وبشكل معنوي بالمقارنة مع السيطرة ، وحدث العكس تماما عند استخدام التركيز الواطيء فظهر تحسن في دورة توالي الخلية الخليةCell Cycle rogression (CCP). وزيادة RI وانخفاض قيمة SCEمعنويا وبنسبة تثبيط 25 % ، في حين لم يكن التركيز الوسطي مؤثرا . اما مستخلص الاسيتونايترال فقد ادت جميع التراكيز المستخدمة الى تسريع دورة الخلية وتقدمها ، كما ازدادت RI وذلك عند حضن المستخلص مع الخلايا لمدة ساعة واحدة بالمقارنة مع السيطرة. وادى ذلك في الوقت ذاته الى انخفاض في SCE بالمقارنة مع السيطرة وبنسبة تثبيط بلغت 6.25 % و6.25 % و16.67 % للتراكيز 10µg/ml و1µg/ml و0.1µg/ml على التوالي. اما عند زيادة فترة الحضن لمدة اطول ( 48 ساعة ) فقد ادى التركيزين العالي والوسطي الى تقدم دورة الخلية وزيادة RI معنويا . رافق ذلك زيادة SCE وبشكل معنوي . بينما ادى التركيز الواطيء الى انخفاض في قيمة SCE وبنسبة تثبيط 16.67 % بالمقارنة مع السيطرة (تاثير Hormetic effect ). وعند زيادة فترة الحضن لمدة 72 ساعة لوحظ بطيء في دورة الخلية وانخفاض RI وبشكل معنوي ، ترافق ذلك مع حدوث زيادة معنوية في SCE عند استخدام التركيزين الوسطي والعالي. وعلى العكس من ذلك ادى التركيز الواطيء الى انخفاض معنوي في SCE وبنسبة تثبيط بلغت 25 % بالمقارنة مع السيطرة (تاثير Hormetic effect ).اختلف المستخلص المائي ومركب الاولندرين في تاثيرهما الايجابي عن بقية المستخلصات اذ كانت جميع التراكيز المستخدمة منهما مؤثرة ولفترة التعريض التي امتدت من الساعة الى الـ 72 ساعة فادت الى تسريع دورة الخلية وتقدمها وازدادت قيمة RI وبشكل معنوي ولجميع التراكيز والمعاملات . شمل هذا التاثير الايجابي ايضا حدوث انخفاض في معدلات SCE معنويا وذلك عند معاملة الخلايا لمدة ساعة واحدة وبنسب تثبيط بلغت 8.33 % و16.67 % و20.83 % للتراكيز 1µg/ml و0.1µg/ml و0.01µg/ml للمستخلص المائي على التوالي و16.67 % و22.97 % و25 % للتراكيز 50 picog/ml و5 picog/ml و0.5 picog/ml لمركب الاولندرين على التوالي. وعند زيادة فترة الحضن لمدة (48 , 72) ساعة فان التركيزين الواطيء والوسطي لم يحدثت ضررا في التركيب الكروموسومي في حين ادى اما عن التاثير السمي على خطوط الخلايا التركيز العالي الى زيادة معنوية في معدل SCE بالمقارنة مع السيطرة ولنفس مدة الحضن . السرطانية فقد وصل التركيز السام للمستخلصات (المثيلي والاسيتونايترال في المثلين كلورايد والمائي) الخام القاتل لنصف عدد الخلايا السرطانية CC50 الى 14 ng/ml، 5.5ng/ml ، 21.5 ng/ml لخط Hep - 2 و19.5 ng/ml و7 ng/ml و21.5 ng/ml لخط AMN - 3 عند حضنها لوحدها من دون مزج لمدة ساعة واحدة . وقد انخفضت هذه التراكيز القاتلة لنصف عدد الخلايا عند معاملتها بالمستخلصات الخام لمدة 72 ساعة . كما اظهرت اغلب المستخلصات الخام سمية اكبر على خط خلاياHep - 2 بالمقارنة مع خط AMN - 3. اما عند استخدام مركب الاولندرين لوحده لمدة ساعة واحدة فقد انخفض التركيز السام والقاتل لنصف عدد الخلايا السرطانية CC50 الى0.54picog/ml و7.5 picog/ml لخط Hep - 2 وAMN - 3 على التوالي بالمقارنة مع المستخلصات الخام . وادى المزج بين المستخلصين الخام المائي والمثيلي ومزيج المستخلصين المثيلي والاسيتونايترايل في المثيلين كلورايد الى انخفاض التركيز السام القاتل لنصف عدد الخلايا السرطانية CC50 عند الحضن لمدتي تعريض (1 و72) ساعة بالمقارنة مع استخدام المستخلصات الخام لوحدها دون مزج ، ولكلا الخطين المستخدمين في التجربة . واظهر الفحص الخلوى بوساطة المجهر الضوئي ان لاستخدام التراكيز الواطئة من المستخلصات الخام ومركب الاولندرين قدرة حالة وسامة خلويا عند فترات الحضن الثلاث تمثلت باحداث تغيرات واضحة في نمو الخلايا السرطانية وفقدانها الشكل الخلوي المميز . بينت نتائج التحليل الكروموسومي للخط الخلوي السرطانـيHep - 2 قبل اضافة اي مستخلص الى وجود خلايا اقل من ثلاثية المجموعة الكروموسومية Hypotriploidy ( 64 كروموسوم) ولم يظهر اي انقسام خلوي عند معاملة الخلايا لساعة واحدة بالمستخلصات ولجميع التراكيز المستخدمة في التجربة .وفي التجارب البايولوجية داخل الجسم الحي in vivo فقد تم تحديد الجرعة الوسطية المميتة LD50 للفئران المختبرية وهي 168.43 mg / kg، 206.11 mg / kg و211.68 mg / kg للمستخلص المائي والمثيلي والاسيتونايترال على التوالي ولمركب الاولندرين 21.525 µg / kg . اما في التجارب العلاجية على الفئران المختبرية الحاملة لسرطان الغدة اللبنية المغروس فقد كشفت نتائج العلاج بجرعات مختلفة من المستخلص المائي الخام ان الجرعتين 16.8 mg/kgو33.6 mg/kg اظهرت ضمورا كاملا للورم بعد اعطاء الحيوان معدل 7 و10 جرع وبنسبة تثبيط بلغت 100% و99.9 % على التوالي . والجرعة الواطئة 8.4 mg/kg اظهرت اختزالا لنمو الورم بنسبة82.54 % بعد اعطاء الحيوان معدل 5 جرعات . واظهر حقن الفئران المصابة بالورم بالمستخلص المثيلي بالجرعة العالية 41.2 mg/kg ضمورا كاملا للورم وذلك بعد اعطاء الحيوان معدل 10 جرعات وبنسبة تثبيط بلغت 100% بالمقارنة مع مجموعتي السيطرة السالبة والموجبة التي استمر نمو الورم فيهما دون توقف حتى موت الحيوان . ووجد ان استخدام المستخلص بالجرعة الاوطا التي مقدارها 20.6 mg/kg اظهرت اختزالا لنمو الورم بنسبة68.612 % وذلك بعد اعطاء الحيوان معدل 18 جرعة . كما اظهر استخدام المستخلص بجرعة مقدارها 10.3 mg/kg اختزالا لنمو الورم بنسبة58.74 % وذلك بعد اعطاء الحيوان معدل 18.7 جرعة. واظهر حقن الفئران المصابة بالورم بمستخلص الاسيتونايترال الخام بالجرعة الوسطية 21.16 g/kg ضمورا كاملا للورم بعد اعطاء الحيوان معدل 11.2 جرعة وبنسبة تثبيط بلغت 96.2% . كما وجد ان استخدام المستخلص بالجرعة الاوطا التي مقدارها 10.58 mg/kg اظهرت اختزالا لنمو الورم بنسبة54.912 % وذلك بعد اعطاء الحيوان معدل 10.6 جرعة . اما استخدام المستخلص بجرعة مقدارها 42.32mg/kg فقد ادى ذلك الى اختزال لنمو الورم بنسبة62.303 % . وقد اظهرت جميع المجاميع العلاجية اطالة واضحة في فترة البقاء على قيد الحياة بالمقارنة مع مجاميع السيطرة . وقد تاثرت اوزان الفئران المختبرية بالعلاجات المستخدمة بالزيادة او النقصان وبشكل يعتمد على نوع المستخلص والجرع المستخدمة .وكشف فحص المقاطع النسيجية للورم المعالج بالجرعتين الوسطية والعليا من المستخلصات الخام عن وجود نسيج ليفي يحيط ببقايا ورم الغدة اللبنية الخبيث مرتشح بعدد من الخلايا الالتهابية وحيدة النواة . واظهرت الجرعات الواطئة وجود تنخر واسع داخل الورم الخبيث ومحاط بنسيج ليفي حبيبي حاوﹴ على الخلايا الالتهابية وحيدة النواة فضلا عن خلايا العدلات. بين الفحص النسيجي للورم المعالج بالجرعة الواطئة والوسطية من مركب الاولندرين وجود مساحات من التنخر مع ارتشاح للخلايا الالتهابية وحيدة النواة . اما العلاج بالجرعة العالية فقد اظهر الفحص المجهري وجود مساحات اوسع من التنخر مع ارتشاح كثيف للخلايا الالتهابية وحيدة النواة وخلايا العدلات. في حين بين الفحص النسيجي لورم سرطان الغدة اللبنية المغروس في الفئران والغير المعالج عن وجود مراحل متقدمة من الورم السرطاني . اظهرت هذه الدراسة ان المستخلصات الخام لاوراق نبات الدفلة من الممكن ان يكون علاجا واعدا للسرطان وتبين ذلك من سلامة استخدامها في علاج سرطان الغدة اللبنية الفاري . ايد ذلك ما اشارت اليه نتائج دراسة تاثير الجرع الواطئة من المستخلصات الخام ومركب الاولندرين في الوراثة الخلوية لخلايا نقي عظم الفئران المختبرية . اذ لم تؤدي الجرعة الواطئة من المستخلص المائي الى تغيرات مهمة احصائيا في كل من MI وBI وC.A وSCE وRIوقد ظهر تحسن في دورة الخلية بالمقارنة مع السيطرة . اما مركب الاولندرين ومستخلص الاسيتونايترايل فقد وجدت ظاهرة الـ Hormetic effect بشكل واضح اذ ادت الجرع الواطئة (العلاجية) الى تحسين دورة الخلية وتقدمها وزيادة معنوية في BI مع عدم حدوث تغيرات مهمة في كل من MI وRI رافق ذلك انخفاضا في C.A وSCE . وحصل العكس من ذلك تماما عند استخدام الجرعة العالية من كلا المعاملتين. اما الجرع المستخدمة من المستخلص المثيلي فظهر تاثيرها الايجابي في الخلية من خلال زيادة MIوBI وCCP ولكن رافق ذلك حدوث زيادة في الـC.A وSCE. | Thirty tow active components analyzed from the different crud extractions of leaves, twenty eight from different crud stems extractions, thirty six from different crud flowers extractions were also analyzed . Some of these components are diagnosis as : Oleaside E, Odorside A, Glucosylnerigoside, Nerigoside, Oleandrin, Adynerin, Olaside A.Different results found in cytotoxic assay of crude extracts & oleandrin on human lymphocyte in vitro. The non cytotoxic concentrations of methanolic extraction were : 0.01µg/mll. The concentration below it shows significance induction on mitotic index and blast index of human lymphocytes but all of higher concentration shows significance reduction on them. This biological phenomenon is called Hormetic effect or Hormesis. The non cytotoxic concentrations of acitonitrial and methelin chlorid system solvent extractions were : 1µg/ml, 0.1µg/ml and 0.01µg/ml. The non cytotoxic concentrations of aquatic extraction were : 1µg/ml, 0.1µg/ml and 0.01µg/ml and whole lower concentrations within (1, 48, 72 hr.) exposure time respectively. All of the higher concentration of these three crude extractions shows significance reduction on mitotic index and blast index of human lymphocytes. The results revealed the inhibitory effect of it by different concentration of oleandrin after (48, 72 hr.) exposure time. Hormesis phenomenon, also, had seen when exposed oleandrin to peripheral blood lymphocytes after one hour exposure time characterized by low dose stimulation, high dose inhibition of mitotic index and blast index significance. The non cytotoxic concentration was 5μg/ml.Studying the effect of crude extracts & oleandrin on human lymphocyte without mitogen (PHA) in different exposure time shows no mitosis. Using different crude extracts & oleandrin in replacement of colchicin shows some mitotic cell with high significance comparison with control.Positive effect were found in CCP by different concentration of methanolic extraction within (1, 48, hr.) exposure time and RI was arise. The higher and medium concentrations perform increased SCE significantly while the lower concentrations resulted decreased of it after (1, 48, hr.) exposure time. This Positive effect in CCP and RI was disappeared when we elongate the exposure time to 72 hr. SCE was significantly increased by the higher concentrations whereas the lower concentrations resulted decreased of it in the same exposure time. All concentrations of acetonitril show improved CCP, increased RI significantly at (48, 72 hr.) exposure time but there were different significance changes in SCE depending on concentration and exposure time. In 1 hr. exposure time, there was decreased of SCE by different concentrations while the higher and medium concentrations of extractions raise SCE within 48 hr. exposure time. The lower concentrations resulted decreased of its spontaneous level in the same exposure time. The aquatic extraction and oleandrin showed different positive effect. They were improved CCP, increased RI significantly at (1, 48, 72 hr.) exposure time by all concentrations. There was significantly decreased of SCE at the time when used different concentrations within 1 hr. exposure time. There were no significance changes in SCE when we used lowered and medium concentrations of aquatic extraction and oleandrin at (48, 72 hr.) exposure times while the high concentrations shows increased of SCE significantly.The cytotoxic assay of crude extractions & oleandrin on two cancer cell lines was studied. The result is a clear cytotoxic activity of those crude extractions & oleandrin with high significances in Hep - 2, AMN - 3 cancer cell lines during the two exposure time. CC50 of methanol, acetonitril and aqueous extraction alone was; 14 ng/ml, 5.5ng/ml and 21.5 ng/ml of Hep - 2 and : 19.5 ng/ml, 7 ng/ml, 21.5 ng/m to AMN - 3 successively within 1 hr. These CC50 was greatly decrease when arise the exposure time to 72 hr., therefore there was difference significances between them. CC50 of oleandrin was 57picog/ml and 750 picog/ml in Hep - 2 & AMN - 3 successively within 1 hr. The result suggested that Hep - 2 cell line the most sensitive cancer cell line to most of crude extracts & oleandrin.Using a mixture of methanol and aqueous crud extractions or methanol and acetonitril crud extractions show reduction of CC50 through (48, 72 hr.) exposure time comparison with extractions without mixing. Microscopic examination of cell line treated with the lower concentrations of crud extractions and oleandrin show large cytotoxic through (48, 72 hr.) exposure time, appear event different changes in morphology of cell line. The effect of crude extractions & oleandrin on chromosomal profile of human cancer cell line (Hep - 2) before treating with different concentrations exhibited a clear Hypotripolidy (64 chromosomes). There was no mitosis cell when we treated cell line (Hep - 2) with low concentrations of extractions within 1 hr. In the first in vivo experiment, LD50 of aqueous, methanol, acetonitril and oleandrin were 168.43 mg / kg, 206.11 mg / kg, 211.68 mg / kg and 21.525 µg / kg.Crud extractions and oleandrin were further used for treatment of mice bearing murine mammary adenocarcinoma system by 3 doses per extractions. Complete regression was seen in 100% of treated mice with the high and medium doses of aqueous extraction while the low doses show partial reduction with 82.54 % growth inhibition. The result indicate that there was complete regression was noted in 100 % of treated mice by high doses of methanol extraction. The low dose exhibit partial reduction with 58.74 % growth inhibition. Reduction by the medium dose was 68.612 %. Complete regression was noted in 96.2% of treated mice by medium doses of acitonitrial extraction. The low dose demonstrates partial reduction with 54.915 % growth inhibition. Reduction by the medium dose was 62.303 %. All treated groups in those experiments showed prolong in surviving. More over, this study showed different changes of adult mice weigh depending on doses.The histopathology examination of treated tumor by high & medium doses of extractions show fibrous connective tissue surrounding the remainder of mammary adenocarcinoma gland filtering with large amount of mononuclear cells and basophile. Lowe doses demonstrate large central necrosis inside malignant mammary adenocarcinoma surrounding by fibrous connective tissue filtering with mononuclear cells and basophile. Histopathology examination of treated tumor by low & medium doses of oleandrin shows area of necrosis while the high doses show large area of necrosis with mononuclear cells and basophile. None treated tumor shows strong condensation of malignant mammary adenocarcenoma cell so that it block off asini of mammary gland adenocarcenoma. No effect has been seen in other organs (heart, kidney and liver) of treated mice with low & high doses of crud extractions & oleandrin. While the liver tissue treated with high doses show bulkiness of liver cell which it recovered liver sinosaet and in another place it seems to be active, occurrence grades of necrosis cell that located around central liver vein, filtering with mononuclear cells around it. Kidney cortical shows hemorrhage from kidney artery with congestion of it in another place and filtering with mononuclear cells. This feature of histopathological examination was similar in almost experiments. This study showed that the crud extractions of Nerium oleander and oleandrin might be promise therapy for cancer; they are safe to use in adult mice. The therapeutic doses of aqueous crud extractions was non cytotoxic to boon marrow cells in mice because there was no significance changes in mitotic index, blast index, sister chromatid exchanges, replicative index and cell cycle regressions.Hormesis effect had seen by oleandrin & acitonitrial extractions time characterized by low dose stimulation, high dose inhibition of MI, BI, CCP, RI, significantly. In contrast, low dose inhibition, high dose stimulation of C.A, SCE. Different concentrations of methanolic extraction were stimulation MI, BI, CCP, RI, significantly but there was stimulation of C.A, SCE. Histopathology examination shows no effect in organs (heart, kidney and liver) of normal mice with therapeutic dose of crud extractions & oleandrin.
