Share
انتاج واستخلاص الكلوكان من خميرة Saccharomyces cerevisiae ودراسة تاثيره في تحفيز الخلايا البلعمية خارج الجسم الحي == Production and extraction of glucan from yeast Saccharomyces cerevisiae and study it's effect in stimulation of phagocytic cells in vitro
Author name:
علي عبد الواحد عبد الربيعي
Supervisor name:
شذى سلمان حسن
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
University of Baghdad
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3090 - p.pdf
Abstract:
تم الحصول على خمس عزلات من خميرة الخبز Saccharomyces cerevisiae اخذت من نماذج مختلفة من الخمائر الجافة المتوافرة في الاسواق المحلية المستوردة من عدة مناشىء ، تم تشخيصها استنادا الى الاختبارات المظهرية والزرعية والكيموحيوية التي اشارت الى انها تعود الى الخميرة المذكورة . استخدمت ست طرائق مختلفة لاستخلاص الكلوكان من الخميرة وكانت ثلاث من هذه الطرائق مستخدمة في دراسات اخرى وثلاث طرائق تم تحويرها وفق الية عمل جديدة تختلف نوعا ما عن الطرائق الثلاث الاخرى ، اظهرت النتائج ان طريقة التحلل الذاتي وطريقة الموجات الصوتية الفائقة (Ultrasonication) المحورتان كانت اكثر ملائمة في الحصول على مستخلص عالي النقاوة حيث اعطت طريقة التحلل الذاتي مستخلصا بنقاوة 94 % واعطت طريقة الموجات الصوتية الفائقة مستخلصا بنقاوة 91 % وكان وزن المستخلصين 4.8 غرام /100 غرام خلايا لطريقة التحلل الذاتي و5.5 غرام / 100 غرام خلايا لطريقة الموجات الصوتية الفائقة ، وان اعلى كمية من مستخلص الكلوكان قد تم الحصول عليها بطريقة Byron 1 والتي بلغت 6.25 غم /100 غرام خميرة بنسبة نقاوة 71 % ، وكانت هذه الطريقة هي الاقل استهلاكا للوقت وللمواد المستخدمة في الاستخلاص بين الطرائق المستخدمة.تم الكشف عن وجود الكلوكان في المستخلصات النهائية باستخدام تقنية الـFT - IR ، بينت نتائج الفحوصات احتواء جميع النماذج على بيتا (3،1) كلوكان ، ولوحظ ايضا خلو جميع النماذج من اي مركب سكري اخر مثل المانان او الكلايكوجين فضلا عن خلوها من البيتا (6،1) كلوكان ، باستثناء ما اشارت اليه الفحوصات من احتواء احد النماذج ( الانموذج G.1) الذي تم الحصول عليه بطريقة (Sakai 1) على نسبة من الكايتين دون بقية النماذج .تم غربلة عزلات الخميرة بالاعتماد على محتواها من الكلوكان ولوحظ ان العزلة S. cerevisiae Sc3 تحتوى على اعلى نسبة من الكلوكان بلغت 3.827 % (وزن /وزن ) من الوزن الجاف للخلايا ، في حين ان اعلى كتلة حيوية للخلايا تم الحصول عليها من العزلة S. cerevisiae Sc5 والتي بلغت 0.8778 غم /100 مللتر . درس تاثير بعض الظروف في انتاج الكلوكان من خلايا الخميرة ولوحظ ان نسبة الكلوكان في الخلايا تختلف باختلاف ظروف النمو ، واشارت النتائج الى ان درجة الحرارة المثلى لانتاج الكلوكان هي 35 م والرقم الهيدروجيني الامثل 6 والمصدر الكربوني الامثل هو السكروز في حين كانت مدة الحضانة المثلى هي 48 ساعة كما لوحظ ان استخدام الحاضنة الهزازة بسرعة 100 دورة / الدقيقة في حضن المزارع يعطي نسبة اعلى من الكلوكان قياسا مع استخدام الحاضنة الساكنة ، استعملت انواعا من الاوساط الخام الطبيعية في تنمية الخميرة مثل وسط مستخلص التمر ومستخلص النخالة التي يمكن ان تكون ملائمة للاستعمال بنطاق واسع وتحقيق مردود اقتصادي فضلا عن الاوساط المختبرية التقليدية المستعملة في الدراسات والبحوث مثل وسط Yeast extract peptone dextrose (YEPD) وبينت النتائج ان وسط مستخلص التمر كان الافضل في الحصول على اعلى نسبة من الكلوكان والتي بلغت 4.664 % (وزن / وزن ) من الوزن الجاف للخلايا كما ان هذا الوسط قد اعطى ايضا اعلى كتلة حيوية من الخلايا بلغت 0.9864 غم / 100 مللتر . درس تاثير ثلاث نماذج من الكلوكان في عملية التهام خميرة Candida albicans من قبل خلايا الدم البيض متعددة اشكال النوى (Polymorphonuclears) خارج الجسم الحي ، تضمنت الانموذج G.3 الذي تم الحصول عليه بطريقة (Byron 1) والانموذج G.5 الذي تم الحصول عليه بطريقة الموجات الصوتية الفائقة والانموذج G.6 الذي تم الحصول عليه بطريقة التحلل الذاتي ، بينت النتائج ان النماذج الثلاثة كان لها تاثيرا واضحا في تحفيز الخلايا البلعمية وزيادة فعاليتها في عملية الالتهام وان هذا التاثير يزداد مع زيادة تركيز نماذج الكلوكان باستثناء التركيز 100 مايكروغرام / مل للانموذج G.3 حيث لم يلاحظ وجود زيادة معنوية في معامل البلعمة قياسا مع معاملة السيطرة ، ولوحظ ان الانموذج G.6 الذي تم الحصول عليه بطريقة التحلل الذاتي وهو الاكثر نقاوة كان هو الافضل في تحفيز الخلايا البلعمية وزيادة قدرتها على الالتهام وان اعلى معامل بلعمة تم الحصول عليه عند التركيز 500 مايكروغرام / مللتر لهذا الانموذج . | Five isolates of the Saccharomyces cerevisiae were obtained from different samples of commercial dry baker yeasts that imported from different origins which purchased from local markets , they were identified depending on morphological , cultural and biochemical tests . Six different extraction methods have been used to extract glucan from the yeast , three of these methods are well documanted in previous studies and ,while the other three methods have been modified (in this study) using new technique differ from the other methods . The results showed that the autolysis and the ultrasonication methods were the best to obtain highly purified extracts , the autolysis method gave glucan extract with 94% purity and the ultrasonication method gave extract with 91% purity , the weight of extracts was 4.8 g /100 g of yeast by the autolysis method and 5.5 g / 100 g of yeast by the ultrasonication method ; The maximum quantity of glucan extract was obtained by (Byron 1) method which is reached 6.25 g/100g of yeast with 71% purity , this method was the least time and materials consumption among the extraction methods used in this study. The presence of glucan in the final extracts that obtained from these methods have been detected by the FT - IR technique , the results shown that all samples contain beta (1,3) glucan , and all samples did not contain any other carbohydrates such as mannan or glycogen as well as beta (1,6) glucan , with exception of sample (G.1) which extracted by (Sakai 1) method contained a proportion of chitin .The S. cerevisiae isolates have been screened depending on glucan content , S. cerevisiae Sc3 gave the highest glucan content reached to 3.827 % (wt / wt ) of dry weight of cells , while the highest cells biomass have been obtained from the S. cerevisiae Sc5 was 0.8778 g/100 ml.The effect of some cultural conditions on glucan content was studied and showed that glucan contents varies with different growth conditions , the result showed that the favorable conditions for glucan production are culturing the yeast in media containing sucrose (5%) with pH 6 and incubated at 35°C in a shaker incubator with 100 rpm for 48 hrs. Some natural crude materials such as date extract and wheat bran were utilized as media for growing of yeast and production of glucan to achieve the economical advantages , date extract was the favorable medium for glucan production since high content of glucan (4.664 % of dry weight of cells ) and highest cells biomass (0.9864 g/100 ml) was achieved from this medium . The effect of three glucan samples on phagocytic process of Candida albicans cells by the polymorphonuclear (PMNs) leucocytes have been studied in vitro , the samples used were G.3 which extracted by (Byron 1) method and G.5 which extracted by (Ultrasonication) method and G.6 which extracted by (autolysis) method, and the results showed that all samples had clear effect in stimulation of the phagocytic cells and increase its phagocytic activity , the stimulating effect increased with increasing of sample concentration , with exception of the concentration 100 µg / ml of sample G.3 which had no significant increasing in the phagocytic index (PI) , the sample G.6 which was obtained by the autolysis method with highest purity was the best in stimulation of the phagocytic cells , and the maximum phagocytic index was obtained at the concentration 500 µg / ml of this sample .
