Share
التشخيص الجزيئي, المظهري واختبار حساسية الفطريات والبكتريا المرافقة لقشرة الشعر مختبريا لعوامل التضاد الميكروبي == Molecular, Phenotyping identification and invitro susceptibility testing in Fungi and Bacteria associated with hair dandruff to antimicrobial agents
Author name:
شيماء محمد علي وتوت
Supervisor name:
زيدان خليف عمران المعموري
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Bacteria
Degree:
Master
University:
University of Babylon - College Of Science For Girls
Language:
English
University location:
Babylon
First pages:
24T3045 - p.pdf
Abstract:
تمثل قشرة الراس اكثر مرض جلدي شيوعا ورغم انها غير مهلكة للحياة فلم تنل قسطا من الاهتمام والبحث على مستوى العالم ولذلك هدفت الدراسة الحالية الى عزل, تشخيص والتحري عن تاثير المضادات الفطرية على الفطريات والخمائر وكذلك عزل وتشخيص البكتريا المرافقة للقشرة الموجودة في فروة الراس ومن شعر هذه الحالات المرضية. خلال مدة الدراسة ولفترة من تشرين الاول الى حزيران 2016 حيث تم جمع 280 عينة قشرة وشعر ومسح من الحالات الموصوفة انفا واشتملت على 152عينة شعر و74 عينة قشرة و54 مسحة من فروة الراس وكذلك جمعت 30 عينة سيطرة. وكل جهد لم يشار اليه بمصدر فهو من جهد الباحث.زرعت العينات على وسط اكار السابرويد والدكستروز(SDA) الحاوي على مضاد السايكلوهكسيمايد وبدونه وشخصت عزلات الخمائر اوليا على وسط CHROMagar للتميز بين انواع الخمائر عن طريق الوانها. كذلك تم التحري عن الفطريات الخيطية الجلدية من خلال زراعتها على وسط اكار السابرويد والدكستروز(SDA) الحاوي على مضاد السايكلوهكسومايد للحصول على عزلات للفطريات الجلدية وكذلك تقييم تواجد الفطريات المترممة مع العينات قيد الدراسة وتقيم عوامل الضراوة لدى الخمائر. تشخيص الفطريات المعزولة على المستوى الجزيئي من خلال تضخيم منطقة ITS باستخدام الزوج الباديئي ITS5/ITS4وITS3/ITS4 واجراء تحليل التتابع DNA sequencing لعينات ممثلة عن المجوعات المتماثلة في اوزانها الجزيئية لمنطقة التضخيم وبعد الحصول على نتائج التضخيم تم اخذ منتج بلمرة لعزلات ممثلة وارسلت الى مختبرMicrogene في امريكا للحصول على التتابع للقواعد النتروجينية ومقارنتها مع تتابع العينات المرجعية في البنك الجيني باستخدام برنامج NCBI )Blast Nucliotide Database). ومطابقة التتابعات لتقييم التماثل والاختلاف ورسم الشجرة التطورية على اساس نتائج تحليل التتابع لتقييم مدى تقارب العزلات ضمن النوع والانواع قيد الدراسة.اظهرت نتائج التشخيص التقليدية والجزيئية باستخدام الازواج البادئية ITS5/ITS4 وITS3/ITS4 كانت اوزان الحزم لكامل منطقة ITS تتراوح بين500 - 800 زوج قاعدي. بينما تراوحت الاوزان لمنطقة ITS2 بين350 - 400زوج قاعدي.واظهرت النتائج ان الطرق الجزيئية المتقدمة هي ادوات قوية لتشخيص الفطريات مقارنة مع الطرق التقليدية. تم تسجيل عزلتين من C. sake و3 عزلة Aurobasidium iranianum وعزلة Issatchenkia orientalis وعزلة من Cryptococcus fonsecae وعزلة واحدة من Cryptococcus diffluens لاول مرة في العراق.اجراء تقييم للفعالية المايكروبية لبعض المستخلصات النباتية المهمة طبيا ومقارنتها مع المضادات الفطرية وتقييم التركيز المثبط الادنى باستخدام شريط E - Test strips .كما تم مسح الانواع البكتيرية المرافقة للعينات قيد الدراسة مجهريا وبايوكيميائيا من خلال زراعتها على الاوساط التفريقية مثل وسط Manitol salt agar ووسط Blood agar base.اظهرت عزلات المبيضات البيضاء موجبة لانتاج الانبوبة الجرثومية, النمو بوجود السايكلوهكسيمايد والنمو في درجة ˚45م. قابلية C.kruzei , C.parapsilosi وC.glabrata على تكوين الغشاء الحيوي . اما اختبار الانزيمات الحالة للدهون المفسفرة فقد كانت موجبة لعزلات C.albicans ,C.parapisilosis وC.kruzei واخيرا اضهر اختبار الانزيمات الحالة للدهون نتيجة موجبة فقط لعزلات C.albicans ,C.tropicalis وC.parapsilosis. كذلك اجريت اختبارات للفطريات الجلدية والتي تضمنت قدرة ال T.rubrum على النمو على وسط SDA with 5% of NaCl وكذلك نمو الفطريات على وسط PDA وانتاج صبغة عكسية.اظهرت النتائج ان لبعض المستخلصات المائية للنباتات تاثير مثبط على نمو الفطريات الجلدية والخمائر وكان المستخلص المائي للقرنفل اكثر فعالية في تثبيط الفطريات الجلدية وبعض الخمائر وال Rhodotorulla وبفرق معنوي ≥ 0.05 يليه الشاي الاخضر والكالبتوز والدارسين والحنة وبتركيز 8 % حيث كان اكثر تاثير من بقية التراكيز.تم اجراء اختبار الحساسية الدوائية لبعض المضادات الفطرية باستخدام E - Test strips للمضادين CAS وFLU حيث اظهرت النتائج مقاومة الفطريات الجلدية والخمائر وال Rhodotorulla للمضادين.تم عزل بكتريا Staph.aurues and Staph.epidermidisوبين اختبار ال Congo red قدرتها على تكوين الغشاء الحيوي Biofilms)). واستنتجت الدراسة ان قشرة الشعر هي مشكلة الشعر المهمة العديد من الخمائر مع الشعر المتساقط معها قد تقف وراءها مجموعة من الفطريات والبكتيريا المتهمة في احداث مثل هكذا اخماج وان استخدام المستخلصات النباتية كانت مؤثرة بشكل معنوي في اختزال نمو الفطريات التي تم اختبارها تحت تاثير هذه النواتج الطبيعية وبغياب الفعالية الدوائية لافضل المضادات الفطرية مثل الفلوكنزول والكاسبوفنجين. ان التشخيص المظهري للعزلات اعتمادا على شكل الخلية لانواع المبيضات والوانها على وسط الكرومواكار هو غير علمي لنجاح التميز بين انواع المبيضات. لذلك تشخيص الانواع بالاعتماد على منطقة ITS يوفر وقتا (والذي ياخذ وقت من يوم الى يومين ) وهي ملائمة وتطبيقية حتى مع العزل التي تمتلك خصائص مظهرية شاذة. | Hair dandruff is a most commercially demoralized skin disease. Although it is not deadly disease, but not have more attention and research worldwide. This study was aimed for isolation, identification and investigation of antifungal susceptibility of dermatophytes and Candida also isolation and identification of bacteria associated with hairs dandruff. During the period from September to June a total of 280 sample of scalp and hair and smear were collected from Hilla hospital private clinics and primary schools in rural areas in the Province of Babylon (n=152 hair samples, n= 74 dandruff samples, n= 54 smear from head scalp) and samples was also collected as 30 control samples. Every effort not referred to source it from researcher effort. Samples cultured on Sabouroud Dextrose Agar (SDA) medium with or without Cyclohexemide based on stander cultured methods, incubation and identification, Primary identification of Candida has been achieved on CHROMagar medium to differential between Candida spp. based on colors. Also it was investigation about dermatophytes through cultivation on Sabouroud Dextrose Agar containing Cyclohexomide to get isolates of dermatophytes, as well as assess the presence of fungus saprophytic with samples under study.Virulence factors for the yeast were detected. Fungal identification based on amplification internal transcript spacer (ITS) region by using ITS5/ITS4, ITS3/ITS4 primers and subject the PCR product to sequence analysis (DNA sequence) for representative samples groups at Micro gene laboratory in US. Sequence analysis based on alignment with data base of reference strains in the gene bank (Blast Nucliotide Database (NCBI) program). phylogeny tree was construction on the basis of the results of the sequence data.Results showed conventional and molecular diagnosis by used ITS5/ITS4 and ITS3/ITS4 primer was band weight integration to ITS region range between 500 - 800 bp. while range weight for ITS2 region between 350 - 400 bp.The results showed that advanced molecular assays were powerful tools for fungal identification compare with the conventional methods. For the first time in Iraq Two isolates from C.sake and one isolate from Issatchenkia orientalis, also three isolates Aurobasidium iranianum and one isolates from Cryptococcus fonsecae and one isolates from Cryptococcus diffluens were recorded.Evaluating the effectiveness of microbial for some medically important plant extracts and compared with the antifungal and assess the minimum inhibitory concentration by used E - Test strips. As it has been cleared bacterial species accompanying to samples under study microscopically and biochemically during cultured on differential medium like manitol salt agar and blood agar base media.C.albicans isolates positive results for germ tube, growth in the presence of Cyclohexomide and growth in temperature 45C˚. C.kruzei, C.parapsilosis, C.glabrata ability composition of biofilms, while phospholipase assay was positive to C.albicans, C.parapisilosis and C.kruzei. Lipase assay was positive to C.albicans, C.tropicalis, C.parapsilosis. As well as conducted test for dermatophytes which include ability of Trichophyton rubrum on growth on SDA with NaCl of 5 % and dermatophytes growth on PDA and produce inverse dye. The results showed that aqueous extracts were reduced the growth of dermatophytes and Candida. The aqueous extract of Cloves more effective in inhibition of dermatophytes, Candida and Rhodotorulla at ≥ 0.05 followed by green tea and Eucalyptus, Cinnomomum, Henna. Moreover 8% concentration was more effective than other concentrations.Tested antifungal sensitivity for some Fluconazole and Caspofungin antifungal using E - Test strips. Showed that dermatophytes, Candida and Rhodotorulla was reveals resistance action against antifungals.Staph.aureus and Staph.epidermidis showed Congo red test and ability for biofilms formation.The study concluded that the hair dandruff is important hair problem, many yeast with the hair loss together may be behind them groups from fungi and bacteria accused in events such as typhoid and used of plant extracts was effected in signification in fungi growth that test under effect this natural products and the absence pharmaceutical activity to best antibiotic such as Fluconazole and Caspofungin. Morphologically identified isolates based on the cell shapes of Candida spp. and their color on CHROMagar isn’t feasible to successfully differentiate between members of the Candida spp. Therefore, identification of Candida and dermatophytes base on ITS region saves time (it takes 2 to 3 days) and is accurate and applicable even to isolates with atypical morphological features.
