Share
استخلاص وتنقية وتوصيف انزيم بيتا - كالاكتوسيديز من كبد الاغنام == Isolated, Purification and Characterization of Beta - Galactosidase from Sheep Liver
Author name:
زهراء عدنان جاسم
Supervisor name:
اياد نافع يحيى | سند باقر محمد
General topic:
Biology
Specific topic:
Life Science
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - Faculty Of Basic Education - Department Of Biology
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3293 - p.pdf
Abstract:
تضمنت الدراسة اختيار افضل طريقة لاستخلاص انزيم البيتاكالاكتوسايديز من كبد الاغنام المحلية, من بين ثمان طرائق, وكان استخدام دارئ الفوسفات (0.2 مولاري وبدالة حموضة 5) هو الافضل في استخلاص الانزيم بفعالية كلية بلغت (78898.5) وحدة. تم ترسيب المحتوى البروتيني باستخدام كبريتات الامونيوم (60)%من بين خمس طرائق للتركيز (التنقية الجزئية), واكملت مراحل التنقية باستخدام التبادل الايوني بعمود DEAE - Sephadex A100 , ومن ثم استخدام الترشيح الهلامي بعمود السيفاكريل S - 300 ( Sephacryl S - 300) اذ بلغت الفعالية النوعية ( 3328.8 ) وحدة / ملغم بروتين والحصيلة الانزيمية مقدارها (41.84)% وعدد مرات التنقية (8.57) مرة. وتم التاكد من نقاوة الانزيم باجراء عملية الترحيل الكهربائي بغياب المواد الماسخة للبروتين اذ ظهرت حزمة بروتينية واحدة في هلام متعدد اكريل امايد, ثم تم توصيف الانزيم واشارت النتائج الى ما ياتي : 1. كان الوزن الجزيئي هو (180) كيلودالتون مقدرا بطريقة الترشيح الهلامي.2. بلغت نقطة التعادل الكهربائي pI للانزيم (4.4).3. اظهرت الدراسة ان الانزيم من البروتينات السكرية وان نسبة الجزء الكربوهيدراتي تشكل (23)% عند تقديرها بطريقة الفينول - حامض الكبريتيك.4. وجد ان الدالة الحمضية الامثل لفعالية الانزيم (5), واظهر الانزيم ثباتا في مدى من قيم دالة الحموضة تراوحت بين (4.5 - 6.5).5. اظهرت النتائج ان درجة الحرارة المثلى لفعالية الانزيم كانت (50) م°, عند دالة الحموضة الامثل لفعالية الانزيم, وان درجة الثبات الحراري لهذا الانزيم بين (25 - 60) م°.6. احتفظ الانزيم بكامل فعاليته الانزيمية عند حضنه بدرجة حرارة (50) م° لمدة (50) دقيقة وفقد (7)% من فعاليته في الدقيقة (60) وفقد (23)% من فعاليته بعد (120) دقيقة.7. بلغت قيمة طاقة التنشيط لتحويل المادة الاساس الى ناتج (8.32) كيلو سعرة / مول, بينما بلغت قيمة طاقة التنشيط لمسخ الانزيم (53.84) كيلو سعرة / مول.8. اظهرت دراسة الثوابت الحركية ان معدلات قيم ثابت ميكالس منتن ( Km ) لتفاعل الانزيم تجاه ONPG كانت ( 0.502) ملغم/مل , بينما بلغت قيمة السرعة القصوى ( Vmax ) للتفاعل الانزيمي (1.106) وحدة/مل.9. اظهرت الايونات الموجبة للمنغنيز والمغنيسيوم تاثيرا منشطا, بينما اظهرت ايونات الكوبلت والزنك والكالسيوم والنحاس تاثيرا مثبطا, فيما لم تؤثر ايونات الباريوم في فعالية الانزيم. 10. وجد ان جميع المثبطات المعدنية المستخدمة في الدراسة سببت تثبيطا بدرجة واضحة مما يعطي دليلا على اشتراك المعادن في تفاعل الانزيم.11. وجد ان المستخلص الانزيمي النقي , له القدرة على تحليل سكر اللاكتوز بكفاءة عالية , اذ ارتفعت نسبة اللاكتوز المتحلل من (25.11)% بعد مرور ساعة من الحضن الى (88.3)% بعد مرور 4 ساعات. | The study included the selection of the best methods to extract the enzyme among eight methods. It appeared that phosphate buffer ( 0.2 M, pH : 5) have given the highest activity of the crude enzyme ( total activity = 78898.5 unit). The protein content was concentrated and precipitated by ammonium sulfate (60) %, among other five methods of concentration (partial purification). The purification stages were achieved by using ion exchange column chromatography ( DEAE - Sephadex A 100 column ). Followed by gel filtration chromatography using Sephacryl S - 300. This method extract pure enzyme at a yield of (41.48) %, (8.57) times of purification and specific activity of (3328.8) unit / mg. The purity of enzyme was certified by poly acryl amide gel electrophoresis under non denaturing condition, the enzyme was characterized by the following : - 1 - Its molecular weight was (180) KD as estimated by gel filtration.2 - Its Iso electric point was at (4.4).3 - The result showed that it was a glycoprotein with a carbohydrate content of (23) % as determined by phenol - sulfuric acid method.4 - Its optimum activity pH was (5). The enzyme was stable at pH range between (4.5 - 6.5).5 - The optimum temperature for enzyme activity was (50) C°at the Optimum pH. The enzyme stability temperature range between (25 - 60) C°. 6 - The enzyme keep full effectiveness when incubated in (50) C° for 50 minutes, and lost (7) % of its effectiveness after (60) minutes, and lost 23% of its effectiveness after (120) minutes.7 - The activation energy to convert the substrate to product was (8.32) kilo calorie / mole. The inactivation energy for the denatured enzyme was (53.84) kilo calorie / mole.8 - The average Michael’s constant ( Km ) for the enzyme reactions towards ONPG were (0.502) mg/ml. and its Vmax was (1.106) unite / minutes 9 - The positive ions such as Mg and Mn have shown activating effect of β - galactosidase, While the Co, Zn, Ca and Cu have on inhibitory effect on the enzyme.10 - Metal inhibitors in habited β - galactosidase clearly meaning that it is metallic protein enzyme.11 - The analytical results have indicated that lactose solution analyzed by enzyme. The hydrolysis rate is increased from (25.11) % after one hour to (88.3) % after (4) hours.
