Share
فصــل وتنقية وتوصيف انزيم الليبوكسيجينيز من لحم الدجاج المحلي == Isolated, Purification and Characterization of Lipoxygenase from Local Chickens Meat
Author name:
منى محمد زيدان
Supervisor name:
اياد نافع يحيى
General topic:
Biology
Specific topic:
Life Science
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - Faculty Of Basic Education
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3425 - p.pdf
Abstract:
تضمنت الدراسة اختيار افضل طريقة لاستخلاص انزيم الليبوكسيجينيز من لحم الدجاج المحلي, من بين ثمان طرائق, وكان كلوريد الصوديوم (10)% هو الافضل في استخلاص الانزيم بفعالية كلية بلغت (918810) وحدة, ركز المحتوى البروتيني باستخدام كبريتات الامونيوم (60)%من بين خمس طرائق للتركيز (التنقية الجزئية), واكملت مراحل التنقية باستخدام التبادل الايوني والترشيح الهلامي بعمود DEAE - Sephadex - A50 , ومن ثم استخدام الترشيح الهلامي بعمود السيفاكريل ( Sephacryl S - 300) اذ بلغت الفعالية النوعية (17.10) وحدة / مل والفعالية الكلية (393) وحدة والحصيلة الانزيمية مقدارها (42.9)% وعدد مرات التنقية (7.50) مرة. وثم التاكد من نقاوة الانزيم باجراء عملية الترحيل الكهربائي بغياب المواد الماسخة للبروتين اذ ظهرت حزمة بروتينية واحدة في هلام متعدد اكريل امايد, ثم تم توصيف الانزيم واشارت النتائج الى ما ياتي : 1. كان الوزن الجزيئي هو (85) كيلودالتون مقدرا بطريقة الترشيح الهلامي.2. بلغت نقطة التعادل الكهربائي pI للانزيم (6.2).3. اظهرت الدراسة ان الانزيم من البروتينات السكرية وان نسبة الجزء الكربوهيدراتي تشكل (9.42)% عند تقديرها بطريقة الفينول - حامض الكبريتيك.4. وجد ان الدالة الحمضية الامثل لفعالية الانزيم (7), واظهر الانزيم ثباتا في مدى من قيم دالة الحموضة تراوحت بين (5 - 9).5. اظهرت النتائج ان درجة الحرارة المثلى لفعالية الانزيم كانت (40) م°, عند دالة الحموضة الامثل لفعالية الانزيم, وان درجة الثبات الحراري لهذا الانزيم بين (10 - 40) م°.6. احتفظ الانزيم بكامل فعاليته الانزيمية عند حضنه بدرجة حرارة (40) م° لمدة (40) دقيقة وفقد (6)% من فعاليته في الدقيقة (50) وفقد (10)% من فعاليته بعد (60) دقيقة.7. بلغت قيمة طاقة التنشيط لتحويل المادة الاساس الى ناتج (8.836) كيلو سعرة / مول, بينما بلغت قيمة طاقة التنشيط لمسخ الانزيم (18.239) كيلو سعرة / مول.8. اظهرت دراسة الثوابت الحركية ان معدلات قيم ثابت ميكالس منتن ( Km ) لتفاعل الانزيم تجاه حامض اللينولييك كانت ( 0.296) ملغم/مل , في حين بلغت قيمة السرعة القصوى ( Vmax ) للتفاعل الانزيمي (1.50) وحدة/مل.9. اظهرت الايونات الموجبة للكالسيوم والمنغنيز والمغنيسيوم والنيكل تاثيرا منشطا, بينما اظهرت ايونات النحاس والحديد والخارصين تاثيرا مثبطا.10. وجد ان جميع المثبطات المعدنية المستخدمة في الدراسة سببت تثبيطا بدرجة واضحة مما يعطي دليلا على اشتراك المعادن في تفاعل الانزيم, اي ان هذا الانزيم من الانزيمات المعدنية. 11. وجد ان المستخلص الانزيمي النقي , له القدرة على تبييض دقيق القمح الاسمر كذلك تحسن الصفات الحسية للخبز المصنوع من الدقيق الاسمر بعد اضافة انزيم الليبوكسيجينيز المستخلص من لحم الدجاج المحلي له. | The study included the selection of the best methods to extract the enzyme among eight methods. It appeared that have given the highest activity of the crude enzyme (total activity = 918810 unit). The protein content was concentrated and precipitated by ammonium sulfate (60) %, among other five methods of concentration (partial purification). The purification stages were achieved by using ion exchange column chromatography (DEAE - Sephadex A - 50 column). Followed by gel filtration chromatography using Sephacryl S - 300. This method extract pure enzyme at a yield of (42.9) %, (7.50) times of purification and specific activity of (17.1) unit / ml. The purity of enzyme was certified by poly acryl amide gel electrophoresis under non denaturing condition, the enzyme was characterized by the following : - 1 - Its molecular weight was (85) KD as estimated by gel filtration.2 - Its Iso electric point was at (6.2).3 - The result showed that it was a glycoprotein with a carbohydrate content of (9.42) % as determined by phenol - sulfuric acid method.4 - Its optimum activity pH was (7). The enzyme was stable at pH range between (5 - 9).5 - The optimum temperature for enzyme activity was (40) C°at the Optimum pH. The enzyme stability temperature range between (10 - 40) C°. 6 - The enzyme keep full effectiveness when his lap (40)C° for (40) minutes, and lost (6) % of its effectiveness after (50) minutes, and lost (10)% of its effectiveness after (60) minutes.7 - The activation energy to convert the substrate to product was (8.836) kilo calorie / mole. The inactivation energy for the denatured enzyme was (18.239) kilo calorie / mole.8 - The average Michael’s constant ( Km ) for the enzyme reactions towards linoleic acid were (0.296) mg/ml. and its Vmax was (1.50) unite / minutes. 9 - The positive ions such as Ca, Mn, Mg and Ni have shown activating effect of Lipoxygenase, while the Cu, Fe and Zn have on inhibitory effect on the enzyme.10 - Metal inhibitors in habited Lipoxygenase clearly meaning that it is metallic protein enzyme.11 - Purified enzyme was clearly bleached the tan color of flour, leading to improvement of properties quality of the produced loaf.
