Share
التغيرات الجينية لانزيم الكلوتاثايون اس - ترانسفريز في بعض العراقيين ومرضى سرطان الثدي == Polymorphism of Glutathione S - Transferase Genes in Some Iraqi Population and Breast Cancer Patients
Author name:
نجلاء قاسم مفتن
Supervisor name:
سلوى حميد ناصر الربيعي | ناهي يوسف ياسين
General topic:
Chemistry
Specific topic:
Analytical Biochemistry
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
25T1859 - p.pdf
Abstract:
انزيمات الكلوتاثيون S - ترانسفيراز(GSTs) تنتمي الى انزيمات الطور الثاني المسؤلة عن ازالة السمية من الخلايا .تلعب هذه الانزيمات دورا هاما في حماية الخلايا من الضرر الذي تسببه المركبات المسرطنة والملوثات والمركبات الغريبة الاخرى ، وبذلك تشكل عاملا حاسما في حماية الحمض النووي. انزيمات GSTs هي انزيمات متعددة الاشكال يختلف نوعها وترددها بين الشعوب . وقد وجد ان تعدد الاشكال في جينات انزيم GSTs يؤثر على فعالية هذه الانزيمات في ازالة السموم ويساهم في التنبؤ للافراد بخطر الاصابة ببعض الامراض وقد يؤثر على استجابة المرضى للعلاج الكيميائي من جهة اخرى .تضمنت هذه الدراسة جزئين : الجزء الاول وكان الهدف منه هو الكشف عن الاشكال الجينية لجينات GSTT1 وGSTM1 وGSTP1 وGSTA1 بين الافراد المتعايشين في مدينة بغداد ومقارنتها مع الشعوب الاخرى. وتعد هذه الدراسة الاولى هي من نوعها في العراق للكشف عن توزيع الانماط الجينية لهذه الجينات معا . تم جمع عينات دم لاستخلاص لحامض النووي من 110شخصا سويا تراوحت اعمارهم بين (15 - 50) سنة ( 51 ذكرا و59 انثى )من مناطق مختلفة من مدينة بغداد . تم اجراء التنميط الجيني للكشف عن وجود او عدم وجود الصنف ميو والصنف ثيتا لجينات الكلوتاثيون - ترانسفيراز ( GSTM1 وGSTT1) على التوالي من خلال تفاعل بلمرة السلسلة المتعددة (Multiplex - PCR) واستخدام جين الالبومين كنموذج سيطرة داخلي . تم الكشف عن تعدد الاشكال الجينية لجينات GSTP1) وGSTA1) من خلال استخدام تقنية التمييز على اساس تعدد طرز اطوال قطع التقييد PCR - RFLP . تم ارسال 11نموذج من نواتج التضخيم لكلا الشريطين الامامي والخلفي لجين GSTP1لغرض تحديد تتابع القواعد النتروجينية وتاكيد نتائج PCR - RFLP . تمت مطابقة تسلسل نواتج التضخيم لجين GSTP1 مع التسلسل القياسي الموجود في NCBI عن طريق برنامج Bioedit كما تم تسجيل 4 من نواتج التضخيم لجين GSTP1 في بنك الجينات العالمي NCBI . كشفت النتائج ان تكرار حذف الجين GSTM1 وحذف الجين GSTT1 كان 34,55٪ و25,45٪ على التوالي. توزيع الانماط الجينية لجين GSTP1 كانت (Ile/ Ile) 54,55 و(Ile/Val)44,55% و(Val/ Val)0,91% بينما كان تردد الاليل 0,7682 للايزوليوسين و0,2318 للفالين اما بالنسبة لجين GSTA1 فكانت النتائج كالتالي (A*/A),58,18% (A*/B*) 41,82% (B/B*) صفر بالمئة وكان تردد الاليل0,79 للاليلA* و0,209للاليل B* .كما كانت هناك علاقة معنوية بين نمط حذف الجين GSTM1والتدخين (p<0.05) . اضهر توزيع الانماط الجينية المشتركة لهذه الجينات الاربعة ان هناك 17 نمط جيني مشترك من 36 نمط ممكن في سكاننا .كما اظهر النمط الجيني المشترك الاكثر شيوعا هو (present GSTM1 ، GSTT1 present، (GSTP1 (Ile/Val ، GSTA1 (A*/A*) الذي يشكل 18,18٪ من المجموع تضمن الجزء الاخر من الدراسة جمع نماذج دم من 65 انثى مصابة بسرطان الاقنية الغازية في الثدي ترواحت اعمارهن بين (29 - 74) سنة من مستشفى الاورام التعليمي ومستشفى اليرموك التعليمي. و59 انثى سليمة (كمجموعة سيطرة )من الجزء الاول من الدراسة لتحديد العلاقة بين تعدد الاشكال في جينات ( GSTM1وGSTT1وGSTP1وGSTA1)وخطر الاصابة بسرطان الثدي . حيث لوحظ وجود زيادة معنوية في تكرار حذف الجين GSTM1 والنمط الوراثي المشترك (حذف الجينGSTM1 - وجود الجين (GSTT1 في مريضات سرطان الثدي مقارنة بالنساء الصحيحات . وكذلك كشفت هذه الدراسة عن وجود فروق ذات دلالة احصائية (P <0.05) في النمط الوراثي Val/Valوتكرار الاليل Val لجين GSTP1 بين مريضات سرطان الثدي والاناث السويات بينما لم يكن هناك فروقات ذات دلالة احصائية في الانماط الوراثية لجينات GSTT1و GSTA1بين مجموعة المريضات ومجموعة السيطرة مما يشير الى عدم وجود علاقة مع خطر الاصابة بسرطان الثدي. كما اضهرت الدراسة ان خطر الاصابة بسرطان الثدي يزداد بمقدار 13 مرة في الاشخاص الذين يمتلكون النمط الجيني المشترك (حذف الجين GSTM1، وجــــود الجين GSTT1، (Ile/Val) GSTP1، (* (A* /B GSTA1). تم ارسال 16نموذج من نواتج التضخيم التضخيم لكلا الشريطين الامامي والخلفي لجين GSTP1 و19نموذج من نواتج التضخيم للشريط الامامي لجين GSTA1 لغرض تحديد تتابع القواعد النتروجينية وتاكيد نتائج PCR - RFLP . تمت مطابقة تسلسل نواتج التضخيم لجينات (GSTP1 وGSTA1) مع التسلسل القياسي لهذه الجينات في NCBI من خلال برنامج BioEdit . حيث تم تسجيل تسع تسلسلات تنتمي لنواتج التضخيم لجين GSTA1 في ثلاثة بنوك جينات عالمية هي بنك الجينات الامريكي من NCBI والبنك الياباني لبيانات DNA (DDBJ) ومعاهد المعلوماتية الحيوية الاوربية (EMBI)والتي تبدا بعدد الانضمام (LC055108) وتنتهي مع (LC055116)كما تم تقييم فعالية انزيم الكلوتاثيون S - ترانسفيراز ومستويات العناصر النزرة (السيلينيوم والنحاس والزنك والحديد) في كريات الدم الحمراء وامصال الدم على التوالي لمجموعتي مريضات سرطان الاقنية الغازية في الثدي ومجموعة السيطرة من اجل تحديد العلاقة المحتملة بين معلمات مضادات الاكسدة الدفاعية وبين تعدد الاشكال الجينية لجينات الكلوتاثيون S - ترانسفيراز في مريضات سرطان الثدي والاناث الصحيحات كمجموعة سيطرة . وقد اضهرت النتائج ان فعالية انزيم الكلوتاثيون S - ترانسفيراز في المريضات اللاتي يعانين من سرطان الثدي كانت اقل معنويا (P <0.05) مقارنة بمجموعة السيطرة . كما كان هناك نقصان معنوي كبير في فعالية الكلوتاثيون S - ترانسفيراز في المريضات اللاتي يمتلكن النمط الوراثي (A*/A*) من GSTA1 (P=0.0044) وكذلك في المريضات اللاتي يمتلكن النمط المشترك (وجود الجين GSTM1 / وجود الجين GSTT1) (P=0.0023) مقارنة مع الاناث السويات يحملون نفس المورثات. لوحظ وجود انخفاض معنوي (p <0.05) في مستوى السيلينيوم وزيادة معنويا (P <0.05) في مستويات (الحديد والنحاس والزنك) في بلازما المريضات مقارنة مع مجموعة السيطرة . كما اشارت الدراسة الى وجود علاقة معنوية بين مستويات هذه العناصر وفعالية انزيم الكلوتاثيون S - ترانسفيراز في مجموعتي التحكم السيطرة ومجموعة المريضات. كما تضمنت الدراسة جمع ثلاثين خزعة نسيجية تم الحصول عليها من 65 مريضة مصابة بسرطان الاقنية الغازية تم ذكرهم مسبقا للكشف عن التعبير الجيني لل GSTP1 في تلك الاورام من خلال تقنية كيمياء الانسجة المناعية من اجل التنبؤ للمريضات بالاستجابة للعلاج الكيميائي. كشفت النتائج ان هناك (77٪) من العينات تظهر تعبير ايجابيا للGSTP1 و(23٪) تضهر تعبير سلبيا . واظهرت النتائج ان ارتفاع التعبير الجيني لجين GSTP1 كان مرتبطا بشكل معنوي (p <0.05) مع خصائص النذير الاكثر فقرا بما في ذلك زيادة العمر ( العمر> 50) سنة، الدرجة الثالث نسيجيا ، المرحلة الثالثة وحجم الورم كبير ( حجم الورم > 2 سم ( . ويمكن استخدام هذا الكشف كفحص روتيني لمريضات سرطان الثدي لانه يعمل كدليل على وجود مقاومة للعلاج الكيميائي. | Glutathione S - transferases (GSTs) enzymes belong to phase II enzymes which is responsible for detoxification from the cells. These enzymes have played an important role in protecting cells from damage caused by carcinogenic compounds, pollutants and other xenobiotic, thus they are crucial in protecting DNA. Glutathione S - transferases are polymorphic enzymes, the type and frequency of polymorphism of GSTs differ among population. Polymorphism of GSTs genes might influence the detoxification activates of the enzymes predisposing individuals to cancer risk and on the other hand may affect on the response of patients to chemotherapy. This study includes two parts : The first part, which was designed to detect polymorphisms in GSTM1 , GSTT1 , GSTP1 and GSTA1 genes between individuals living in the city of Baghdad and compare it with other population . This is the first study in Iraq for the detection of genotypes distribution of these genes together.Blood samples were collected from 110 healthy individuals (15 - 50 years) (51 males and 59 females) from different regions of Baghdad city. Genomic DNA was extracted then genotyping was performed to detect the presence or absence of Mu class and Theta class of glutathione S - transferase genes (GSTM1and GSTT1) by multiplex polymerase chain reaction(Multiplex - PCR) and using albumin as internal control. As well as polymorphism of GSTP1 (Ile105Val) and GSTA1 (A*/B*) were detected by restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction (RFLP - PCR). Eleven samples of PCR products of both forward and reverse strands of the gene GSTP1 were sent for sequencing in order to confirm the results of RFLP - PCR and these sequences were alignment with the standard sequence of GSTP1 gene found in NCBI through Bioedit program . Four of these sequences were recorded in Gene Bank NCBI.The results revealed distribution of GSTM1 deletion and GSTT1 deletion, were 34.55% , 25.45% respectively .Frequency distribution of GSTP1 genotypes were 54.55%( (Ile/Ile), 44.55% (Ile/Val),0.91%(Val/Val) whereas allele frequency was 0.7682 for Ile allele and 0.2318 for Val allele.As for GSTA1, the results were 58.18%(A*/A*),41.82%(A*/B*),0.0% (B*/B*) while allele frequency was 0.79 for allele A* and 0.209 for allele B* . As well as there was a significant association between GSTM1 - deletion genotype and smoking (P < 0.05). The combined genotypes distribution of GSTM1, GSTT1,GSTP1 and GSTA1 polymorphisms showed that 17 of 36 possible genotypes were present in Iraqi population .The most frequent combined genotype was 18.18 %(GSTM1 present,GSTT1 present ,GSTP1 (Ile105 Val),GSTA1 (A*/A*) ).The other part of study includes 65 females with invasive ductal carcinoma in breast cancer (29 - 74 years) from Oncology Teaching Hospital and Al - Yarmouk Teaching Hospital as well as 59 females as control group from the first part of study to determine if the frequencies of polymorphisms of GSTT1, GSTM1 ,GSTP1 and GSTA1 genes associated with risk of breast cancer.Statistically significant increase in frequencies of GSTM1 - deletion genotype and combination genotype (deletion GSTM1, present GSTT1)were observed in breast cancer patients compared to healthy females. As well as this study revealed that there was significant differences (p<0.05) in Val/Val genotype and the frequency of Val allele of GSTP1 gene between breast patients cancer and healthy females . Whereas there was no significant differences found in genotypes of GSTA1 and GSTT1 genes between patients and control group. The risk of breast cancer increases 13 fold in individuals with the combined genotype (deletion GSTM1, present GSTT1,(Ile/Val) of GSTP1,(A*/B*) of GSTA1). Sixteen samples of PCR products of both forward and reverse strands of GSTP1 gene and nineteen samples of PCR products of forward strand of GSTA1 gene were sent for sequencing in order to confirm the results of RFLP - PCR and these sequence were alignment with the standard sequence found in NCBI through Bioedit program . This study involves submission of nine sequences belong to the products amplification of GSTA1 in three global gene banks, American gene bank of NCBI, DNA data bank of Japan (DDBJ) and European Bioinformatics institutes (EMBI)under the accession number started with (LC055108)and end with (LC055116). The activity of GST and levels of trace elements (Se, Cu, Zn, Fe) in erythrocyte and plasma respectively in patients and controls were evaluated for identifying potential relationships between antioxidant defense parameters measured in blood and GST genetic polymorphisms in breast cancer patients and healthy females . The results revealed that the activity of GST in patients with breast cancer were significantly lower (p<0.05) than in control group . There were large significant decreases in the activity of GST in patient having A*/A* genotype of GSTA1 (p=0.0044) and in patient carrying (present GSTM1/present GSTT1)(p=0.0023) comparing to healthy females carrying the same genotypes. It was observed significant decrease (p<0.05) in the level of selenium and significant increase (p<0.05) in the levels of (Fe, Cu, Zn) in plasma of patients compared to control group. The study also indicated the existence of a significant relationship between levels of these elements and polymorphism of GSTs genes in the two groups (controls and patients).This study includes collecting of thirty tissue biopsies that were obtained from 65 patients with invasive ductal carcinoma which has already been mentioned above to detect the expression of GSTP1 in these tumor by Immunohistochemistry technique in order to predict the response of chemotherapy . The results showed that there were (77%) of samples revealed positive expression of GSTP1 and (23%) revealed negative expression .The results exhibited that high GSTP1 expression was significantly associated with poorer prognostic characteristics including higher age (>50) years, grade III histology, stage III and large tumor size(>2cm),(p< 0.05). This detection may applied as routine clinical test, it serves as a marker for resistance of chemotherapy in patients with breast cancer.
