Share
دراسة وراثية خلوية وجزيئية بين عينة من المرضى المصابين بالهوجكنزلمفوما == Cytogenetic and molecular study among Hodgkin’s lymphoma patients
Author name:
اسراء حسين حمزة
Supervisor name:
عبد الامير ناصر الركابي | عبد الحسين مويت الفيصل
General topic:
Biology
Specific topic:
Zoology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3183 - p.pdf
Abstract:
صممت هذه الدراسة لفحص وتحديد نسبة انتشار التناقل الكروموسومي لكروموسومي (14و18) الذي يحدث بين جين bcl2و JH في بعض المرضى العراقين المصابين بسرطان الهوجكن لمفوما وايضا تم التحرى عن جين (BNRF1)الخاص بفايروس (EBV)كذلك تم التحرى عن التشوهات الكروموسومية بواسطة استخدام تقنية التهجين الموضعي . تضمنت الدراسة 75 عينة من المرضى المصابين (25 عينة من الدم و50 عين من الخزع النسيجية المحفوظة بالفورمالين والمطمورة بشمع البارافين) مع عشر عينات من الخزع النسيجية التابعة لمرضى الاورام الحميدة .تم جمع الدم من وحدة امراض الدم في مستشفى بغداد في مدينة الطب ببغداد. اما الخزع النسيجية فقد جمعت من مختبرات الامراض النسيجية في مختلف المستشفيات خلال الفترة من شهر ايلول لعام 2013 لغاية شهر اذار لعام 2014. ان تحديد وفحص التناقل الكرموسومي )14;18) تضمن المناطق المتغايرة بالجين الورمي bcl2 وهي منطقة الانكسار الرئيسية MBR التي تقع بالجزء الغير مشفر بالنهاية 3ʹومنطقة الانكسار الثانوية MCR ولتحديد علاقة هذه المناطق بالتناقل الكروموسومي فقد تم استخدام تسعة بوادى امامية من الجين الورمي bcl2 وبادئ واحد عكسي من جين JH بالاضافة الى السيطرة الموجبة لكل منطقة انكسار والذي تم تصنيعه في المختبر باستخدام تقنية الربط وبناء القطع والذي يعتبر اول دراسة في هذا المجال في العراق والشرق الاوسط. .تم تضخيم الحامض النووي دنا(DNA ) لكل عينات المرضى المصابة بسرطان الهوجكنز لمفوما وعينات المستخدمة للسيطرة بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل PCR والتتابع المباشر والتي تضمنت استخدام ثلاث مجاميع من البوادئ لتغطية المناطق الانكسار المراد فحصها على الجين الورميbcl2 على كروموسوم 18. وقد تم تصميم هذه البوادئ باستعمال برامج NCBI (Primer plus 3) حيث تم تصميم بوادئ امامية لكل من (MBR(MBR1,MBR2) و3MBR(3MBR1, 3MBR2, 3MBR3, 3MBR4) وMCR(MCR1,MCR2, 5MCR)) وتم تصميم بادئ عكسي من جينJH لكل هذه البوادئ الامامية وتم استخدامهم لكل العينات المراد فحصها للانتقال الكروموسومي (14و18) كل على انفراد وباستخدام سيطرة موجبة للفحص والذي تم تصنيعه بالمختبر باستخدام تقنية التضخيم المتداخل والتضخيم متعدد الارسال. وقد تم ضبط ظروف التضخيم وحسب البوادئ المستخدمة وفحص الناتج بواسطة الترحيل الكهربائي لتحديد العينات الموجبة للتناقل ثم تحديد موقع التناقل بواسطة طريقة التتابع المباشر ومقارنتها مع التتابع المباشر للسيطرة الموجبة. كما تم استخدام الدنا المستخلص سابقا لتحديد وجود جين BNRF1 الخاص بفايرس EBVبواسطة استخدام تقنية التضخيم العددي ((qRT - PCR واستخدام تتابع نيوكليوتيدي (بادئ) ومجس خاص . بالاضافة الى استخدام تقنية التهجين الموضعي لتحديد التشوهات الكرموسومية في بعض من عينات الخزع النسيجية المثبتة على سلايدات التهجين الخاصة بذلك .وقد اظهرت الدراسة النتائج التالية : هناك فروق معنوية عالية (p<0.01) بين العوامل المتغيرة في التجربة كما اوضحت النتائج ان نسبة انتشار المرض كان بالاعمار البالغين بين (60 - 70) سنة بنسبة (25.33%) وبالنسبة للجنس فقد حقق جنس الذكور نسبة حدوث اكثر من الاناث وبنسبة (58.67%) اما بالنسبة الى نوع المرض فقد سجل نوع Mixed cellularity اعلى نسبة حدوث بالنسبة للانواع الاخرى من المرض (53.33%)اما بالنسبة الى موقع العقد اللمفاوية المصابة بالورم فكانت اكثر الاماكن اصابة وحدوث الورم هي العقد اللمفاوية العنقية (53.33%) . واظهرت نتائج الدراسة ان نسبة انتشار الانحراف الكروموسومي للجين الورمي في المرضى المصابين بورم الهوجكن ظهر في 26(35%) عينة موجبة وكان 5(19.2%) منهم بمنطقة الانكسار MBR1 و4(15.38%)في منطقة الانكسار MBR2 و3(11.5%) في منطقة 3MBR1 و2(8%) في منطقة 3MBR2 و7(27%) في منطقة 3MBR4 ولم تظهر اي نتيجة موجبة في المنطقة 3MBR3 اما بالنسبة الى مناطق الانكسار الثانوية فقد سجلت 4(15.38) في منطقة الانكسارMCR1 و1(4%) في منطقة MCR2 و2(8%) في منطقة الانكسار 5MCR ولم تسجل اي نتيجة موجبة بالنسبة للعينات الاورام الحميدة المستخدمة للسيطرة . وبهذا فقد بينت النتائج ان نسبة انتشار الانحراف كانت في مناطق الانكسار الرئيسية اكثر من مناطق الانكسار الثانوية. وبالنسبة الى العمر فان نسبة الانتشار كانت باعمار البالغين والاكثر عند الذكور وبفروق معنوية عالية ايضا. بعد تحليل النتائج بواسطة طريقة التتابع المباشرة ومقارنتها بنتائج الموقع العالمي للمعلومات الجينية (NCBI) ومقارنتها كذلك مع تتابع السيطرة الموجبة . تم تقديم العينات ذات الحجم المساوي الى bp200 او اكثر الى بنك الجينات في المواقع العالمية لتسجيل التتابعات الجينية حيث تم تسجيلها في الموقع الامريكي ال(Gene Bank) وتم تسيجلها في الموقع الاوربي (EMBL) كذلك تم التمكن من تسجيلها في الموقع الياباني لبنك الجينات (DDBJ) وتم الموافقة ونشرت تحت عنوان : (Homo sapiens DNA, IGH/BCL2 transition region, isolate : hodgkins - bcl2 - t (14 - 18) mbr - p.)واعطيت ارقام تعليم خاصة بها في بنك الجينات تبدا من (LC041134 - LC041142) واعتبرت كمصدر عن معلومات العراقيين الجينية والتي تعتبر قليلة ضمن بنك الجينات العالمي. كما اظهرت النتائج وجود 40(53.33%) حالة موجبة وبفروق معنوية عالية لجين الابشتاين بار فايروس لمرضى الاورام اللمفية الهوجكن مقارنة بالاورام الحميدة التي لم تظهر اي نتيجة موجبة . اضافة الى ذلك اظهرت النتائج ان اكثر المرضى المصابين بالفايروس كانوا من جنس الذكور ومن نوع Mixed cellularity HL . في مايتعلق باختبار التهجين الموضعي فقد اظهرت النتائج وجود عينة واحدة موجبة للفحص من اصل 6 عينات. نستنتج من هذه الدراسة ان تحديد الانتقال الكروموسومي (14;18) في مرضى الاورام اللمفية الهوجكن يمكن تحديدها باستخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل وباستخدام عدة بوادئ لكل مناطق الانكسار الرئيسية والثانوية .اضافة الى استنتاج دقة اختبار التضخيم الكمي في تقيم وتحديد الفايرس ومن الممكن اعتبارها كوسيلة لتشخيص الاورام اللمفية واي نوع من السرطان ذات العلاقة بالفايرس والذي يعتبر كمؤشر للورم.اما بالنسبة لتقنية التهجين الموضعي فقد تبين انها ادق من تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل وذلك بسبب كبر حجم المجس الضوئي المستخدم للفحص . | The study was design to investigate and to determine the frequency of chromosomal translocation involve the bcl2 and JH genes t (14, 18) (q32; q21) in some of Hodgkin’s lymphoma Iraqi patients. The study also aimed to detect the BNRF1 gene of EBV in patients and using FISH technique for other chromosomal aberrations in the same patients. The study include 75 Iraqi patients with Hodgkin’s lymphoma (25 samples as blood and 50 samples as formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissue blocks) and 10 samples as reactive hyperplasia blocks for control. The blood samples were collected from hematology unit in Baghdad hospital in medical city but paraffin blocks tissue were collected from histopathological laboratories in different hospitals during the period from September 2013 till March 2014. The detection of t (14; 18) translocation involved the hot spots regions of the bcl2 gene which included the major breakpoints region (MBR located in the 3ʹ untranslated region of bcl2 exon 3) and the minor cluster region (MCR located in the 3ʹ region of bcl2 exon 3). To detect the involvement of these regions in the t (14; 18), nine forward primers were used for bcl2 regions and one reverse primer for JH gene as well as to positive controls for each breakpoints which were prepared by synthesized artificial chromosomal translocation in laboratory by using splicing technique and construct fragments of genes and considered the first work in this field not just in Iraq or middle east but in all world. The DNA for all samples was submitted for PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification which performed using three set of primers (multiple primers) defined multiplex PCR to detect MBR, 3ʹMBR and MCR regions on bcl2 gene on 18 chromosome, the three set primers which designed by using NCBI programs (Primer plus 3 program) as forward primer [forward MBR (MBR1,MBR2), 3MBR( 3MBR1, 3MBR2, 3MBR3, 3MBR4), MCR (MCR1, MCR2, 5MCR) and reverse primers (reverse JH used ) in which case each of primer sets forward were used to evaluate the transposition of t (14;18) separately for the same samples with positive control for each breakpoint that was synthesized in lab by nested and multiple primers defined multiplex PCR. The PCR conditions were optimized according to suitable sets of primers used for reproducing the replacement. By gel electrophoresis for the products to identify the fragments with juxtaposed bcl2 and IGH JH enhancer positive and subjected for genotype analysis [these artificial breakpoints (positive control) and each positive samples for t(14, 18) assay] by using Sanger method with Agencourt® CleanSEQ® dye - terminator Removal Kit for direct sequence analysis. The DNA which was extracted before was also used to detect the existence of BNRF1 gene specific for EBV loaded in patients samples by using real time quantitation PCR (qRT - PCR) with specific primer and probe. In addition to use FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) technique to detect abnormal chromosome in tissue samples with the PathVysion Kit applied on tissue section fixed on positive charge slides (thermo fisher scientific). The unstained 3 µm sections of six samples were tested for t (14; 18) using a dual color - dual fusion translocation probes set (Vysis LSI IgH/ BCL2; Abbott Molecular). A total of 200 interphase nuclei were enumerated and scored for the presence of two fusion signals per nuclei. The results in this study showed high significant (P<0.01) between parameters. The results reported that the age of HL patients in the current study ranged between 10 - 80 years and more incidences in old adult with the age range (60 - 70) years (25.33%). There were males predominance among HL patients 44(58.67%) than females 31(41.33%) with high significant (P<0.01). The highest subtype HL number was recorded in mixed cellularity (MC) (53.33%). The cervical lymph node was recorded the highest infected site and included tumor 53.33% than other sites of lymph node and according to stage of disease , most cases in the current study were stage II (72%). Regard to the t (14;18) chromosomal translocation the results noticed a total of 26(35%) positive cases showed IGH/BCL2 gene rearrangement with high significant compared with control. 5 (19.2%) for major breakpoint MBR1, 4(15.38%) for MBR2 and (3(11.5%);2(8%);7(27%)) for 3ʹMBR1, 3ʹMBR2 and 3ʹMBR4 respectively but no cases positive for 3ʹMBR3 while (MCR1, MCR2, 5ʹMCR) were recorded in (4(15.38%); 1(4%); 2(8%)) respectively. And (0%) in reactive hyperplasia for control. The results indicate higher frequency of breakpoints in the MBR regions than MCR cluster region, and the incidence of t (14; 18) translocation was increased in adult’s age depending on age while depending on gander the incidence among males was high. After the sequence analysis for all breakpoints sequence and compared with NCBI by (http : //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and compared with construct fragment sequence (positive control). The breakpoints sequence that its product size equal 200 bp or more that were submitted to the NCBI (National Center for Biotechnology Information) site for registration in the Gene Bank database, (DNA Data Bank of Japan) (DDBJ) and in the EMBL (European Molecular Biology Laboratory) and accepted in these three international sites for bioinformatics, thus published under title (Homo sapiens DNA, IGH/BCL2 transition region, isolate : hodgkins - bcl2 - t(14 - 18) mbr - p.) with special ID number (Accession number) specific for these breakpoints sequence which is begin from (LC041134 to LC041142) in gene bank database and considered as a document reference about Iraq people data which is little in gene bank database. The EBV DNA genome encoding the non - glycosylated membrane protein (BNRF1) was detected in 40(53.33%) positive cases of 75 Hodgkin’s lymphoma samples and no cases positive for EBV in reactive hyperplasia with high significant . The majority of positive patients were males 33(82.5%) than females. In addition to the EBV was more frequently detected in mixed cellularity subtype of HL 27(67.5%). According to the FISH assay, the results showed that just one sample from six was positive for t (14; 18) translocation and this case was recorded negative results in PCR assay. In conclusion, the detection of t (14; 18) in HL patients can be achieved by PCR technique by including multiple primers for all three breakpoint regions which are MBR, 3ʹMBR, MCR and performing multiplex amplification. And the positive fragments can also be used as an indicator of minimal residual disease following treatment. The qPCR assay allows precise quantification of EBV load and can be used as a tool for diagnosis and management of EBV related lymphoma patients and for any cancers that EBV DNA may be considered as tumor biomarker. The FISH technique considered more sensitive than PCR for detection t (14, 18) because of large size of FISH probes which used in technology, the IGH probe labeled in green is about 1.5 Mb and includes nearly the entire IgH locus and 300 kb beyond the 3ʹ end and the locus - specific bcl2 probe labeled in orange about 750 kb to include the entire bcl2 gene sequence and additional sequence extending about 250 kb distal and proximal to the ge
