Share
تقدير الاسبارجين في مرضى سرطان الدم بوساطة الاسبارجينيز المقيد والمنقى من Portulaca oleracea L == Estimation of Asparagine in Serum Leukemia Patients by Immobilized L - asparaginase Purified from Portulaca oleracea L
Author name:
هادي ساجد عبد العباس عبد الله
Supervisor name:
محمد عبد الله جبر جاسم
General topic:
Biology
Specific topic:
Biotechnologies
Degree:
Master
University:
University of Babylon - College Of Science - Department Of Biology
Language:
Arabic
University location:
Babylon
First pages:
24T3505 - p.pdf
Abstract:
جمعت عينات النباتات قيد الدراسة من منطقة الرارنجية \مدينة الحلة\العراق. وصنفت النباتات من قبل د.نداء عدنان في قسم علوم الحياة \كلية العلوم \جامعة بابل بالاعتماد على الصفات المظهرية للنباتات . تم التحري عن فعالية انزيم الاسباراجينيز والمحتوى البروتيني في المستخلص الخام لهذه النباتات , تبين ان اعلى فعالية نوعية لانزيم الاسباراجينيز في نبات البربينة Portulaca oleracea L., ثم قدرت الفعالية الانزيمية في اجزاء النبات والتي شملت (الاواق, السيقان,الجذور, نبات كامل) حيث ظهرت اعلى فعالية في النبات الكامل مقارنة بالاجزاء الاخرى ,بالاعتماد على هذه النتائج استخدم نبات البربينة Portulaca oleracea L. كمصدر لانتاج وتنقية وتوصيف والاستخدام الطبي لانزيم الاسباراجينيز.درست الظروف المثلى لفعالية انزيم الاسباراجينيز من النبات الكامل وقد اشارت النتائج الى ان اعلى فعالية للانزيم قد تحققت بحضن الانزيم الخام مع الاسبراجين بتركيز 200mM بنسبة 1 : 3 في محلول دارئ فوسفات البوتاسيوم المنظم بتركيز 0.05 مولار بدالة حامضية 8 وبدرجة حرارة 37 م مع الانخفاض التدريجي في الفعالية النوعية للانزيم الخام بعد خزنه لفترات زمنية محددة .تم تنقية انزيم الاسباراجينيز الخام المستخلص من نبات البربينة بثلاث خطوات تضمنت الاولى الترسيب بكبريتات الامونيوم بنسبة 90% ثم التنقية بكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي باستحدام السيفاديكس G - 100 وبعدها التنقية بكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي باستخدام السيفاديكس G - 150 وقد ظهرت ثلاثة اشكال للانزيم حيث بلغت الفعالية النوعية للانزيم النقي 7440 وحدة\ملغم وعدد مرات التنقية 4.08 وبحصيلة انزيمية بلغت 22.7%.تم توصيف الاسباراجينيز النقي ,اذ بلغ الوزن الجزيئي52±1 كيلو دالتون باستخدام كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي باستخدام السيفاديكس G - 100 بوجود البروتينات القياسية والتي هي Trypsin (23 KD), Pepsin (34.5 KD), Egg Albumin (43KD) , and Bovine serum albumin (67 KD) وكان الرقم الهيدروجيني الامثل لفعالية وثبات الانزيم هو 8 في حين كانت درجة الحرارة المثلى لفعالية وثبات الانزيم هي 37 م وعند دراسة الثوابت الحركية للانزيم , ظهر ان معدلات قيم ثابت ميكالس (Km) والسرعة القصوى (Vmax) وعدد التحول(Kcat ) كانت 250 ملي مولار و100 ملي مولار \دقيقة و350 1\ثانية على التوالي. قيد الانزيم باستعمال الاكار,الاكاروز والجيلاتين وتم توصيف الانزيم المقيد ومقارنته مع الانزيم الحر. اظهرت نتائج الدراسة كفاءة التقييد باستعمال مادة الاكاروز والاكار والجلاتين حيث بلغت ( (70,72,78 % على التوالي وكما تبين من النتائج ان اعلى فعالية للانزيم الحر والمقيد بالاكاروز كانت عند الدالة الحامضية 8 اما الانزيم المقيد بالاكار والجيلاتين فكانت اعلى فعالية عند الدالة الحامضية 9. بالمقابل كانت درجة الحرارة 37 م هي المثلى للفعالية للانزيم المقيد بالاكار والجيلاتين والحر و40 م للانزيم المقيد بالاكاروز. واستخدم الانزيم المقيد في تقدير تركيز الاسبارجين في مصل الدم , اظهرت النتاج ارتفاع واضح في تركيز الاسباراجين لمرضى اللوكيميا (سرطان الدم) حيث بلغت〖10〗^( - 2) - 〖10〗^( - 3) مولار مقارنة مع الاشخاص الطبيعيين حيث بلغت〖10〗^( - 4) - 〖10〗^( - 7) مولار | Plants samples were collected during 2016 (August to September) from Al - Raranjia Hamlet field / Al - Hilah city / Iraq. These samples were classified by Dr. Nidaa Adnan Muhammed ,Biology Department/ Collage of Science / University of Babylon , according to their morphological characteristics. Activity of asparaginase was detected in whole plant, leaves, steems and roots extracts. Results showed that Portulaca oleracea L. was the best one from group of tested plants for research due high yield of L - asparaginase enzyme . Maximum asparaginase activity was detected in whole plant extracts which was 43.55 U/ml in comparison with 37.74,33.16 and 36.8 U/ml in extracts of leaves, steems and roots respectively. According to these results whole plant of Portulaca oleracea L. were used as a source for asparaginase production, purification , characterization, and medical application . Activity of crude asparaginase extracted from whole plant were under optimal conditions studied. Results revealed the maximum activity of asparaginase was achieved when the enzyme was incubated with asparagine 200mM at 37°C in the presence of potassium phosphate buffer 0.05 M solution/plant sample (g) (3 : 1 ratio) at pH8 , with gradually increase in activity with increase of the substrate and gradually activity decrease after particular storage period. Crude asparaginase extract was purified in three steps ( Ammonium sulfate precipitation (90%), gel filtration chromatography technique by Sephadex G - 100 and gel filtration chromatography method by Sephadex G - 150. There are three isoform of enzyme while Specific activity of the purified asparaginase was 7440 U/mg and 4.08 Purification folds, 14.5 % yield. Characterization of the purified asparaginase showed that the molecular weight of the enzyme was 52±1 Kilo Dalton by gel filtration chromatography using Sephadex G - 100 in the presence of four standard proteins which they are Trypsin (23 KD), Pepsin (34.5 KD), Egg Albumin (43KD) , and Bovine serum albumin (67 KD). pH 8 was the optimum pH for enzyme activity and stability, while 37°C was the optimum temperature for both enzyme activity and stability, with Km of 250 mM toward L - asparagine as substrate and the maximum velocity (Vmax) and Kcat of 100 mM/min, 350 sec^( - 1) respectively . The activity of immobilized enzyme was determined and compared with free enzyme ,where immobilizing Efficiency of agar , agarose and gelatin techniques was ( 72 %,78 % and 70 % ) respectively, all immobilizing technique proved that the activity of the enzyme was increased significantly compared with free enzyme, where agar and gelatin methods showed more stability of enzyme at alkaline pH (pH 9) , whereas only agarose method get the enzyme more heat stability to enzyme than other immobilizing methods. There are significant elevation level of asparagine concentration in leukemic human serum samples than normal human serum samples , where reached to 〖10〗^( - 4) - 〖10〗^( - 7) M of asparagine in normal human serum samples while it was 〖10〗^( - 2) - 〖10〗^( - 3) M of asparagine in leukemic serum blood samples.
