Share
التوصيف المظهري والوراثي للانزيمات المحورة لمضادات الامينوكلايكوسيدية المنتجة من المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثسلين == Phenotypic and genotypic characterization of aminoglycoside modifying enzymes produced by methecillin resistant Staphylococcus aureus
Author name:
شيــماء عدنان جبر العبيــــدي
Supervisor name:
سوسن ساجد محمد علي الجبوري
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - College Of Education For Pure Sciences
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3355 - p.pdf
Abstract:
• جمعت 150عزلة سريرية من المكورات العنقودية من مستشفيي الحبيبية والنعمان في مدينة بغداد خلال الفترة من شهر كانون الثاني وحتى شهر نيسان لعام 2011 من اصابات سريرية متنوعة. توزعت العينات ما بين 30 عزلة من الادرار, 84 من خمجات جروح و36 عزلة من مسحات الاذن . • شخصت العزلات مبدئيا بزراعتها على وسطي اكار الماكونكي واكار الدم, تبع ذلك اجراء عدد من الفحوص الشكلية والكيموحيوية, ثم شخصت العزلات بشكل نهائي ودقيق باستخدام اشرطة نظامي api staph وMast staph kit .لقد تم الحصول على 87 عزلة (58%) على انها Staphylococcus .aureus مقابل 63 عزلة (42%) للانواع الاخرى من هذا الجنس. • بينت نتائج الفحص المسحي المظهري الاولي لمقاومة مضاد المثسلين باستخدام طريقة الانتشاربالاكار ان هنالك 84 عزلة من اصل 87 (%96.5) قد اظهرت مقاومتها لمضاد المثسلين لتكون من المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للمثسلين((MRSA مقابل 3عزلات فقط (3.5%) مستجيبة للمثسلين (MSSA).• اجري اختبارفحص الحساسية للمضادات الحيوية بطريقة انتشارالاقراص لجميع عزلات MRSA( ,(84 واستخدم لهذا الغرض ستة مضادات حيوية تعود للمجموعة الامينوكلايكوسيدية . اوضحت النتائج وجوداختلافات واضحة في نمط المقاومة المظهري للعزلات قيد الدراسة اذا اظهرت هذه العزلات مستوى عال من المقاومة لهذه المجموعة مع نسبة وصلت الى ( 19٪ ( للستربتوميسين, 38)٪ (للاميكاسين, ( 52٪ ( للجنتاميسين ، 62٪) للكاناميسين ،و (69٪) لكل من مضادي ا لنيومايسين والتوبراميسين. • استخدمت طريقة التراكيز المتضاعفة المتسلسلة لحساب التركيز المثبط الادنى(MIC) لعزلات ال MRSA) (لعدد من مضادات المجموعة الامينوكلايكوسيدية . بينت النتائج وجود اختلافات في قيم MIC المحسوبة لعزلات ال MRSA، اذا اظهرت 16 عزلة مقاومتها للستربتومايسين وبقيم MIC تراوحت ما بين (16 - 1024 ميكروغرام / مل ) , و32 عزلة مقاومة للاميكاسين (64 - 128 ميكروغرام/مل ) ، و44 عزلة للجنتاميسين ( 16 - 64 ميكروغرام/مل ) و38 لو 52عزلة للكانامايسين ( 64 - 128مايكروغرام/ مل) , ، و58 للنيوميسين (16 - 1024 ميكروغرام/مل ). ان هذه النتائج تدل على انتشار صفة مقاومة مضادات المجموعة الامينوكلايكوسايدية بين عزلات المكورات العنقودية المقاومة للمثسيلين .• اعتمدت طريقتان لتحضير الدنا القالب لغرض استخدامها في التفاعل التضاعفي لسلسلة الدنا ( PCR) وهما : طريقة الغليان وطريقة المستعمرة المباشر. اظهرت النتيجة ان طريقة المستعمرة المباشرة كان افضل في اظهار النتائج بالمقارنة مع طريقة الغليان.• اختيرت خمسة وعشرون عزلة من بكتريا MRSA التي اعطت نتائج ايجابية في مجال الكشف المظهري لنمط المقاومة لمضاد المثسلين ولمضادات المجموعة الامينوكلايكوسيدية للكشف عن الجين mecA المشفرلمقاومة المثيسلين بوساطة تقنية التفاعل التضاعفي لسلسلة الدنا (PCR) . اظهرت نتائج احتواء جميع العزلات (100٪) على جين mecA ,وبلغ حجم القطعة المكثرة 314 زوج قاعدة بمقارنتها بدلائل الدنا الحجمية .• اجري الفحص الوراثي بتقنية ال PCR للكشف عن ثلاث جينات مشفرة للانزيمات المحورة لمضادات المجـــموعة الامــينوكلايكوسيـــدية في عــزلات ال MRSA وشـمـــلت aac(6’) - Ie+aph(2’), ant(4’) - Ia, and aph(3’) - IIIa.بينت النتائج ان جين ) ′aac(6’) - Ie+aph(2’ هو الاكثر انتشارا وبنسبة 84٪ (21/25) تلاه جين ant(4’) - Iaو aph(3’) - IIIa بنسبة 76.3٪ (19/25) و44٪ (11/25) على التوالي.• بلغ معدل تواجد aac(6’) - Ie+aph(2’) مع ant(4’) - Ia, مقدار 64٪ (16 / 25) ويمثل اعلى نسبة تواجد في العزلات قيد الدراسة, فيما بلغت نسبة تواجد جيني ant(4’) - Ia وaph(3’) - IIIaمعا 40٪ (10/25) لتحل نسبة تواجد كلا من aac(6’) - Ie+aph(2’) مع aph(3’) - IIIa ثالثا وبمعدل 32٪ (8/25).اما نسبة تواجد هذه الجينات الثلاث معا فقد بلغ 28%(7/21(. • لوحظ ان هنالك ترابط بين الصفة المظهرية لمقاومة المضادرات مع الصفة الوراثية , فقد لوحظ ان العزلات الحاملة لجين aac(6’) - Ie+aph(2’) ذات مقاومة عالية لمضاد الجنتامايسين وايضا مقاومة لاغلب انواع المضادات الامينوكلايكوسيدية الاخرى.بينما كانت العزلات الحاملة للجين ant(4’) - Ia هي عزلات ذات مقاومة عالية لمضادي التوبرامايسين والنيومايسين ,ومن ناحية اخرى كانت العزلات الحاملة للجين aph(3’) - IIIa اظهرت مقاومتها العالية للمضادين الكانامايسين والاميكاسين.• في هذه الدراسة كانتالاربع وعشرين 24 عزلة الحاملة لجين mecA من اصل 25) 96%( كانت على الاقل مترابطة مع احد جينات الانزيمات المحورة AME او اثنان منها او جميعا ,ويعد هذا مؤشرا لوجود ترابط كبير بين مقاومة العزلات لمضادات الامينو كلايكوسايدية وبين مقاومتها للمثسلين في العزلات المحلية .في الوقت نفسة ظهرت ضمن النتائج عزلة MRSA واحدة اتسمت بمقاومتها المظهرية لمضادات هذه المجموعة غير انها خلت من اي جين في الفحص الوراثي مما يدل على امتلاكها نمط اخر من المقاومة تجاه هذة المجموعة . | • A total of 150 Clinical isolates of Staphylococcus species were collected from two hospitals : Al - habibia and Noaman hospitals in Baghdad city during the period from January to April 2011. Types and the numbers of these clinical samples were distributed as (30) isolates from urine, (84) isolates from wound infections and (36) isolates from ear swabs. • The isolates were initially diagnosed by culturing on MacConkey agar and blood agar followed by performing some morphological and biochemical tests . A confirmatory test as final diagnoses were done using api 20 and MAST staph kits. The results have showed that Staphylococcus aureus comprised 87(58%) isolates while other Staphylococcus species represented 63 isolates (42%) .• Results of primary screening test for methicillin resistance using disk diffusion method have revealed that 84 isolates(96.5%) were proved to be methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA), while only 3 isolates (3.5%)were methicillin sensetive Staphylococcus aureus (MSSA).• Antibiotic susceptibility test for all the 84 MRSA isolates was performed against 6 antibiotic of aminoglycosides group using disc diffusion method. The result have demonstrated clear differences in the phenotypic resistance among isolates of the current study . They showed high - level of resistance to aminoglycosides group, and the percentage of isolates reached to(19%) for streptomycin, (38% ) for amikacin ,(52% ) for gentamicin, (62%) for kanamycin and ( 69%) for each of neomycin and tobramycin . • Two fold was serial dilution agar used to determine the minimum inhibitory concentrations (MIC) for the MRSA isolates against aminoglycosides group. The results have showed that there were differences in the MIC values among MRSA isolates when 16 isolates were resistance streptomycin (MIC ranged 16 - 1024 µg/ ml) , 32 isolates resistance amikacin (64 - 128 µg/ ml), 44 isolates to gentamicin (16 - 64 µg/ ml) , 52 isolates to kanamycin (64 - 128µg /ml), and 58 isolates to neomycin (16 - 1024 µg/ ml). The results indicate the prevalence of aminoglycosides resistance pattern in all the MRSA isolates. • The two different methods boiling method and the direct colony method were used to prepare template DNA in order to be used in the polymerase chain reaction test. The results revealed that the direct colony methode was better in demonstrating the result as comparied with the boiling method . • Twenty five isolates which gave positive results in phenotypic detection for methicillin and aminoglycoside group resistance , were selected to detect mecA gene encoding methicillin resistance using PCR technique.The results showed that all the isolates (100%) harbored merA gene with amplified size 314 bp as compared with DAN ladder . • Genotypic detection was performed to detect three genes encoding aminoglycoside modifying enzymes in MRSA isolates. They were aac(6’) - Ie+aph(2’), ant(4’) - Ia, and aph(3’) - IIIa genes.The results showed that aac(6') - Ie - aph(2") gene was the most prevalent Aminoglycoside modifying enzymes (AME) gene when the rate was 84% (21/25) of the resistant isolates followed by ant(4') - Ia and aph(3') - IIIa when the rates were 76.3% (19/25) and 44% (11/25) of these isolates respectively.• The coexistence rate of aac(6') - Ie - aph(2") with ant(4') - Ia was 68% (16/25) which it represents the most predominant rate in the isolates of the current study followed by the coexistence between of ant(4') - Ia with aph(3') - IIIa which was 40% (10/25) and the third rate for aac(6') - Ie - aph(2") with aph(3') - IIIa by 32% (8/25). The coexistence rate of the three genes in all the isolates was 28% (7/25).• The results of the current study showed that there was a correlation between phenotypic and genotypic resistance pattern.The isolates harboring aac(6’) - Ie+aph(2’) gene are considered to be high resistant to gentamicin and even to all aminoglycosides ,while the isolates harboring this gene were highly resistant to tobramycin and neomycin and the isolates carrying aph(3′) - IIIa gene showed the high resistance to amikacin and kanamycin in MRSA. • In this study, the 24 isolates harboring mecA gene out of 25 ( 96%) were carried either one or more than one aminoglycoside modifying gene and this represents an indicator for high correlation between aminoglycoside and methicillin resistance in our local isolates .From the other hand the results showed that there was a MRSA isolates which confer phenotypic resistance to aminoglycoside group but it not encode for any of AME gene ,this may indicate that such isolates confer another type of resistance toward this group
