Share
استخلاص ، تنقية وتوصيف انزيم اللكنين بيروكسيديز المنتج من العزلة الفطرية المحلية Aspergillus terreus == Extraction, purification and characterization of lignin peroxidase enzyme produced from local fungal isolate Aspergillus terreus
Author name:
سحر غازي عمران عبد الواحد التميمي
Supervisor name:
ندى صباح رزوقي | غازي منعم عزيز
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
University of Baghdad
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3304 - p.pdf
Abstract:
تم عزل وتشخيص 18 عزلة فطرية محلية من 75 عينة روث خيول جمعت من نادي الجادرية ونادي العامرية للفروسية في بغداد خلال 8 اشهر للفترة من تموز 2013 الى اذار 2014 . سجلت العزلة A. niger اعلى نسبة ظهور بين العزلات واعلى تكرار % 80 %9.8, على التوالي تبعتها العزلة A.fumigatus (%9.8 , % 48) ثم العزلة A.terreus (% 8.2 , % 46.66) ، بينما سجلت العزلة Absidia cerymbifera اقل ظهور واقل تكرار(%3.28 , % 5.33) تبعتها العزلة Syncephalstrum racemosum ( % 2.67 و( %1.64 على التوالي. اختيرت العزلة A.terreus SG777 كافضل عزلة لانتاج هذه الانزيمات اذ سجلت اعلى فاعلية نوعية لانتاج الانزيمات المحللة للكنين ( لكنين بيروكسيديز 11.828 ، منغنيز بيروكسيديز1.131 واللاكيز 0.527) وحدة /ملغم . ثبتت الظروف المثلى لانتاج الانزيمات المحللة لللكنين من العزلة الفطرية A. terreus SG 777 باستخدام تخمرات الحالة الصلبة ( سيقان الموز كمادة اساس ، فترة الحضن 8 ايام ،حجم اللقاح1 × 105 بوغ / مل ، برقم هيدروجيني 4.5 وبدرجة حرارة 35م°). رسب انزيم اللكنين بيروكسيديز باستخدام كبريتات الامونيوم بنسبة اشباع %80 ثم ازيل الملح من الانزيم المنتج من عفن777 Aspergillus terreus SG باستخدام طريقة النضح الغشائيDialysis تجاه المحلول الدارئ (Tris buffer) ونقي جزئيا بواسطة كروماتوغرافيا التبادل الايونيIon exchange chromatography باستخدام المبادل الايوني DEAE - cellulose بعدد مرات للتنقية بلغ 5.4 مرة وبحصيلة انزيمية مقدارها %13.7اظهر الانزيم اعلى فغالية وثباتية عند الرقم الهيدروجيني 3.0 ,في حين اقصى فاعلية للانزيم ظهرت عند درجة حرارة 40 م° مع احتفاظ الانزيم بفاعليته عند درجات حرارة تراوحت بين 25) - 35 ) م°. درست قابلية انزيم اللكنين بيروكسيديز في ازالة عدة صبغات واظهرت النتائج اعلى نسبة ازالة ( 83.61 %) للانزيم تجاه صبغة الكونغو الحمراء باستخدام 65.51 وحدة / مل منه وبفترة حضن 4 ساعات وتبعتها صبغة المثيلين الزرقاء بنسية تحطيم %58.6 ثم صبغة المثيل الحمراء بنسبة ازالة بلغت % 49.9.بينما سجلت الصبغات الملاكايت الخضراء ، الالورا الحمراء والتارترازين % 24.87 ,% 28.8 , %26 على التوالي كادنى نسبة تحطيم بوساطة الانزيم قيد الدراسة . درست قابلية انزيم اللكنين بيروكسيديز في ازالة المركبات الحلقية المتعددة التي تم الكشف عنها وذلك لمقارنة فاعلية الانزيم مع نتائج المعالجات في مصفى الدورة والتي تضمنت (المعالجة الميكانيكية، المعالجة الكيميوفيزيائية والمعالجة البايولوجية ) . اظهرت النتائج ازالة 97.54 % للمركب Di benzo (a ,h) anthrancene باستخدام 65.51 وحدة / مل من الانزيم قيد الدراسة وبفترة حضن 4 ساعات وبدرجة حرارة 40 م° في حين بلغت نسبة الازالة بوساطة معالجات المصفى % 54.37 كما بلغت نسبة الازالة لكل من Floureneو anthrancene قد بلغت % 95.98 و% 83.51 على التوالي مقارنة بنسبة الازالة %84.51 , % 46.83 بوساطة معالجات المصفى . قيد انزيم اللكنين بيروكسيديز باستخدام %2 وزن / حجم من الجينات الصوديوم و200 ملي مولار و50 من مل كلوريد الكالسيوم . بينت النتائج ان % 99 من فاعلية الانزيم الحر تم تقييدها .اجريت عملية خزن انزيم اللكنين بيروكسيديز المقيد والحر لمدة اربعة اسابيع عند درجة حرارة 4 م° لمعرفة مدى احتفاظ الانزيم المقيد بفاعليته الانزيمية مقارنة بالانزيم الحر، اذ لوحظ ان الانزيم المقيد قد احتفظ % 88.29 من فاعليته الاصلية بينما احتفظ الانزيم الحر حوالي 66. 02 % من فاعليته الاصلية. استخدم انزيم اللكنين بيروكسيديز المقيد والحر في تحطيم صبغة المثيلين الزرقاء ، اذ اظهرت النتائج ان نسبة التحطيم بالانزيم المقيد بلغت حوالي % 40.1 لفترة حضن 4 ساعات بينما بلغت نسبة تحطيم الصبغة حوالي % 25.79 باستخدام الانزيم الحر وبنفس فترة الحضن .حطم انزيم اللكنين بيروكسيديز المقيد حوالي% 57.89 من صبغة الكونغو الحمراء عند استخدامه لاول مرة ، وانخفضت قابلية الانزيم المقيد على تحطيم الصبغة الى 16.11% عند استعماله للمرة الرابعة. | Eighteen local isolates were collected from seventy five horse manure samples taken from horses in the Equestrian Club in Jadriya and Al - Amrya / Baghdad that were investigated during the 8 months; the period isolation was started from July 2013 to march 2014. Aspergillus niger was the highest occurrence and frequency (80% and 9.8 %) respectively, followed by A . fumigatus (48 % and 9.8 %) and A. terreus (46.66 % and 8.2 % ) occurrence and frequency respectively , whereas Syncephalstrum racemosum (2.67 % and 1.64%) respectively . The isolate A. terreus had the higher specific activity of ligninolytic enzymes (lignin peroxidase 11.828, manganese peroxidase 1.13 and laccase 0.53) U/mg. The optimum conditions of ligninolytic enzymes produced from A. terreus SG777 were estimated using solid state fermentation : banana stalks as a substrate, period incubation 8 days, moisture level 1 : 5 w/v inoculum size 1x105 spores /ml, pH 4.5 and temperature 35 °C. Lignin peroxidase produced from A. terreus SG777 precipitated with 80% ammonium sulfate saturation then desalting by dialysis against Tris buffer solution and partially purified by ion exchange chromatography using DEAE - cellulose. The specific activity reached 56.67U/mg with purification fold was 5.4 times and 13.7% recovery. The optimum pH for activity and stability was 3. The maximum activity was observed at 40°C and the enzyme maintained the activity when it was incubated at 25 - 35˚C. Lignin peroxidase removal the dyes during 4hr. Congo red was decolorized to the maximum extent of 83.61% in 4 hr by 65. 51 U/ml of the pure lignin peroxidase, methylene blue decolorized 58.6% and methyl red azo dye was decolorized to the extent of 49.9% ,while Malachite green triarylmethane dye, allura red and tartarazine showed minimum extent decolorized 26, 28.8 and 24.87% respectively. Degradation of poly aromatic hydrocarbons when incubated with 65.51 U/ml lignin peroxidase at 40 °C for 4 hr compared with the Refinery treatment . Results showed (97.54%) removal efficiency of Di benzo (a ,h) anthrancene by lignin peroxidase, while only 54.37% was treated by Refinery treatment. Flourene and anthrancene degradation 95.98% and 83.51% respectively, while the flourene and anthrancene degradation treated by Refinery treatment only 84.51% and 46.83% respectively. Lignin peroxidase immobilization by 2% (w/v) sodium alginate and 200 mM of calcium chloride. Results showed that 99 % from free lignin peroxidase was immobilized. The stability of immobilized and free Lip enzyme was studied during four weeks; remaining activity for immobilized Lip was 88.29 % from its original activity 76 U/ml during four weeks while free Lip remaining activity was 66. 02 % from its original activity (76.04 U/ml). Methylene blue dye degraded about 40.1% by immobilized Lip during four hr compared with free Lip which has removal only 25.79% from dye concentration. The immobilization lignin peroxidase removal 57.89 % from congo red in first use and then the immobilized lignin peroxidase ability reduced to 16.11% dye removal after four uses.
