دراسة الانتشار والتوصيف الجزيئي للبكتريا الهشة المنتجة للذيفان المعوي ETBF والفايروسات الدوارة نوع A المعزولة من الاطفال المصابين بالاسهال == Prevalence and Molecular Characterization of Enterotoxigenic Bacteroides fragilis (ETBF) and Rotavirus - A from Children with Acute Diarrhea
Author name:
سالي فاضل لفتة الجبوري
Supervisor name:
علاء هاني الجراخ | عبد النبي جويد عبد
General topic:
Medicine
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
University of Babylon - Faculty Of Medicine
Language:
English
University location:
Babylon
First pages:
19T1724 - p.pdf
Abstract:
استهدفت هذه الدراسة المقطعية التحري عن مدى تفشي الفايروس الدوار Rotavirus والبكتريا الهشة المنتجة للذيفان المعوي لدى الاطفال الذين يعانون من الاسهال الحاد بواسطة طريقة الفحص المناعي المرتبط بالانزيم والفحص الجزيئي وتحديد نمط حساسية المضادات الحيوية لهذه البكتريا الهشة المنتجة للذيفان المعوي باستخدام فحص انتاج البيتا لاكتاميز. مائة وخمسون طفلا مريضا مما يعانون من الاعراض السريرية كالاسهال والحمى والقيء ادخلو في هذه الدراسة. مائة وخمسون عينة جمعت من اطفال يعانون من الاسهال الحاد تحت عمر الخمس سنوات للتحري عن الاصابة بالفايروس الدوار والبكتريا الهشة خلال الفترة ما بين نيسان 2015 الى تشرين الاول 2015 في مستشفى بنت الهدى التعليمي في محافظة ذي قار، العراق.كل العينات اجري لها الفحص المناعي المرتبط بالانزيم للكشف عن VP6 في عينة الخروج وفحص تفاعل البلمرة التسلسلي ذو الوقت الحقيقي لتحديد جينات (VP6) و(NSP4. اظهرت النتائج انه نسبة تفشي الفايروس الدوار كانت 33.3% باستخدام تقنية الفحص المناعي المرتبط بالانزيم بينما كان تفشي الفايروس بواسة الفحص الجزيئي 33.3% لجين (VP6) و34% لجين (NSP4) . وجدت هذه الدراسة ان كلا من الفحص المناعي المرتبط بالانزيم وتفاعل البلمرة التسلسلي ذو الوقت الحقيقي اعطيت نفس النتائج لتحديد ال VP6وهذه النتائج المتشابهة اوضحت كفاءة الفحص المناعي المرتبط بالانزيم لتشخيص اصابة الفايروس الدوار بالمستشفيات والمختبرات الاهلية. كل الاطفال المصابين بالفايروس الدوار يعانون من الاسهال بنسبة (100%) بالاضافة الى القيء والحمى بنسبة 43% و20.8% تباعا وبفرق معنوي (p<o.o1). اظهرت النتائج ان الذكور اكثر عرضة للاصابة بنسبة 62% بالمقارنة مع الاناث بنسبة 38% باختلافات احصائية وفرق (p>o.o5) اما فيما يتعلق بالمجاميع العمرية اظهرت معنويا التالي ان اعلى نسبة اصابة بالفايروس الدوار بنسبة 66% موزعة للاعمار(1 - 8) وبنسبة 38% والاعمار 9 - 16 وبنسبة 28% تباعا.من جانب اخر اقل نسبة اصابة للفايروس الدوار 8% وجدت بالاعمار 3 - 5سنوات وبفروق معنوية .(p < 0.01).معدل الاصابة يزداد بنقصان عمر الاطفال. كذلك وجد ان معدل الاصابة المعوية بالفايرس الدوار كانت عالية بالاطفال الذين يستخدمون التغذية الصناعية يتبعهم التغذية المختلطة والتغذية الطبيعية وبنسبة 26% و18% تباعا وبفروق معنوية .(p < 0.01). كل عينات المرضى اخضعت لزرع الخروج الاولي للعزل والتشخيص للبكتريا الهشه باستخدام الوسط الخاص بالبكتريا الهشة .(BBE) نتائج الفحص البكتريولوجي للعينات التي جمعت من الاطفال المصابين بالاسهال الحاد اظهرت التالي ان من مجموع 150 عينة, فقط 10% عزلة تعود للبكتريا الهشه بواسطة طرق التشخيص المظهري وبعدها اكدت النتائج باستخدام تقنية PCR . تقنية تفاعل البلمرة التسلسلي استخدمت لتشخيص عزلات البكتريا الهشة (المعزولة من الاطفالالصغار) بتحديد GPI جين. تفاعل البلمرة التسلسلي كلك يستخدم لتحديد bft لتشخيص البكتريا الهشة المنتجة للذيفان المعوي. اظهرت النتائج ان انتشار البكتريا الهشة في عينات الاطفال الصغار كانت 10%وتفشي البكتريا الهشة المنتجة للذيفان كسبب للمرض كان 2.6 % من العينات السريرية. الذكور تكون اكثر عرضة للاصابة بالبكتريا الهشة مقارنة مع الاناث 33.3 . احصائيا الاختلافات بين الجنسين كانت بفروق معنوية (p>o.o5). معدل الاصابة يزداد بنقصان عمر الاطفال. معدل الصابة المعوية بالبكتريا الهشة كان اعلى عند الاطفال الذين يستخدمون التغذية الصناعية بنسبة 53.3% يتبعها التغذية المختلطة والطبيعية وبنسبة 33.3%و13.3 % تباعا. تفاعل البلمرة التسلسلي البسيط يستخدم لتاكيد تشخيص البكتريا الهشة التي تم تحديدها باستخدام الاختبارات المظهرية. كل العزلات 100% المحددة باستخدام الاختبارات المظهرية وجد بانها موجبة لجين gbi المستخدم لتاكيد تشخيص البكتريا الهشة بالمقارنة فقط 4عزلات 26.6% كانت موجبة لوجود bft جين . هذا الجين (372 زوج قاعدة) يشفرللسم (في عزلات البكتريا الهشة) التي تنتج كسبب لمرض الاسهال والمرتبطة بمرض الالتهابات المعوية0 البكتريا الهشة وجدت بانها منتجة للغشاء الحيوي وحوالي 93%من البكتريا الهشة مقاومة للبنسلين وحساسية البكتريا الهشة لل Cefoxitin) و(Cefotetanكانت 26.6% و46.6% عزلة مقاومة لهذه المضادات تباعا. فيما يتعلق بصنف Carbapenemes)) من المضادات, نتائج الحساسية للبكتريا الهشة لل( Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Doripenem,) كانت 6.6%, 13.3%, 13.3% و20%مقاومة لهذه المضادات تباعا. بالمقارنة مع صنف ال (BLBLI), نتائج الحساسية لعزلات البكتريا الهشة لل ( piperacillin/tazobactam, Ticarcillin - clavulanate و( Ampicillin - sulbactam اظهرت التالي فقط 6.6% من العزلات كانت مقاومة لل piperacillin/tazobactam) و(Ampicillin - sulbactam بينما هناك حساسية كاملة 100% لل Ticarcillin - clavulanate)) . من بين 15 عزلة للبكتريا الهشة المفحوصة , 86.6% وجد بانها منتجة لل (β - lactamase) بينما 13.3% من العزلات لم تظهر مثل هذه النتائج. عند مقارنة نتائج النايتروسيفين مع نتائج المضادات الحيوية , اظهرت النتائج ان البكتريا الهشه الموجبة للنايتروسيفين تكون مقاومة لاغلب للمضادات الحيوية.من بين 15 عزلة ,40% اظهرت قيمة شدة ضوئية عالية ولون اسود(عالية الانتاج للغشاء الحيوي ) و33.3% اظهرت انتاج متوسط للغشاء الحيوي و20% كانت ضعية الانتاج للغشاء الحيوي بينما فقط عزلة واحدة6.6% كانت غير منتجة للغشاء الحيوي. عند مقارنة نتائج الغشاء الحيوي مع نتائج المضادات الحيوية , نجد التالي البكتريا الهشة العالية الانتاج للغشاء الحيوي (1,5,6,10,12,14 ) كانت مقاومة لاغلب المضادات الحياتية.هذه الدراسة كذلك اظهرت ان كل عزلات البكتريا الهشة المنتجة للغشاء الحيوي (1,5,6,10,12,14) كانت عالية المقاومة للمضادات (Ampicillin, Amoxicillin, Cefoxitin, Cefotetan, Cefotaxime, Ceftriaxone, Clindamycin) بينما عزلة البكتريا الهشة غير المنتجة للغشاء الحيوي كانت عالية الحساسية لكل المضادات الحياتية المستخدمة بالدراسة. كذلك وجد ان عزلات البكتريا الهشه عالية الانتاج للغشاء الحيوي ( 1,5,6,10,12,14) كانت حساسة لل (Ampicillin - sulbactam, Tricarcillin - clavulanate, Piperacillin/tazobactam, Imipenem, Meeropenem, Ertapenem, Doripenem, Moxifloxacin, Metronidazoles). | This cross sectional study was aimed to investigate the prevalence of Rotavirus and Enterotoxigenic B. fragilis (ETBF) among children with acute diarrhea by Enzyme Linked Immune Sorbent Assay and molecular methods and determination of antibiotic susceptibility patterns of ETBF using β - lactamase production test. One hundred and fifty stool samples were obtained from children. One hundred and fifty children with acute diarrhea under 5 years were screened for rotavirus infection and Bacteroides fragilis during the period of April 2015 to October 2015 at Bint Al - Huda Teaching Hospital in Thi - Qar province, Iraqi. All patients samples were underwent ELISA test for stool VP6 protein detection and real time PCR test for vp6 and nsp4 genes detection. The results showed that the frequency of Rotavirus infection was 33.3% by ELISA technique, and 33.3% for vp6 gene and 34% for nsp4 gene by molecular method. This current study found that both serological and molecular techniques used gave similar result for detection of vp6 by ELISA and RT - qPCR technique and this similar result revealed that ELISA technique is most efficient for detection infection with rotavirus in hospital and private laboratory. All of rotavirus - positive children (No.= 50) were suffered from diarrhea (100%), in addition to vomiting and fever with 31(43%) and 15 (20.8%), respectively with significantly (p<o.o1). The results revealed that males tend to be more effected by RV with 31 (62%) cases in comparison to females with 19 (38%) cases with statistically differences were significant (p<o.o5) while regarding to age groups showed that, significantly, the height RV - positive infection with a total of 33 (66%) cases, distributed to age group 1 - 8 months (38%) and age group 9 - 16 months (28%), respectively. On the other hand the lowest infection with rotavirus (8 %) found in age group (3 - 5 years). This variation of the above results was statistically significant (p < 0.01). The infection rate had increased with decreasing the age of the children. Also found that the rate of RV gastroenteritis found to be the highest in children who were using bottle feeding (56%), followed by mixed feeding and breast feeding (26%) and (18%), respectively. This variation of the above results was statistically significant (p < 0.01). All patients were underwent primary stool culture for isolation and presumptive identification of B. fragilis using B. fragilis isolation agar (BBE). Results of bacteriological examination of samples collected from children with acute gastroenteritis showed that out of 150 samples, Only 15 (10 %) isolates belonged to B. fragilis by phenotypic identification methods and then confirmed using PCR technique. Polymerase chain reaction (PCR) technique was used for diagnosis of B. fragilis isolates (recovered from pediatric patients) by detection of gbi gene. PCR was also used for detection of bft gene for ETBF identification. The results showed that the frequency of B. fragilis infection in pediatric patients was (10%) and the prevalence of ETBF isolates as a cause of diarrheal illness in 2.66% of clinical samples. Males tend to be more effected by B. fragilis with (66.6%) cases in compares to females (33.3%) cases. Statistically, sex differences were significant (p>o.o5). The infection rate had increased with decreasing the age of the children. The rate of B. fragilis gastroenteritis was found to be the highest in children who were using bottle feeding with 8 (53.33%) child, followed by mixed feeding and breast feeding with (33.3%) and (13.3%), respectively. Simplex PCR assay had been used for confirmation the diagnosis of B. fragillis detected by phenotypic tests. All isolates (No. 15, 100%) detected by phenotypic tests, were found to be positive with gbi gene which using for confirmatory detection of B. fragillis. In contrast only 4 isolates (26.6%) were positive for the presence of bft gene. These genes (372pb) are encoding for toxin (in B. fragillis isolates) which produced as a cause of diarrheal illness, associated with inflammatory bowel disease. B. fragilis isolates were found to be biofilm producers and about Ninety - three percent of B. fragilis strains were resistant to ampicilin and susceptibility of B. fragilis isolates to Cefoxitin and Cefotetan, were (26.6%) isolates and (46.6%) isolates resistant to these antibiotics respectively. Regarding to Carbapenemes class of antibiotics, results of susceptibility of B. fragilis isolates to Imipenem, Meropenem, Ertapenem and Doripenem, were (6.6%), (13.3%), (13.3%), and (20%), resistant to these antibiotics respectively. In contrast to β - lactam - β - lactamase inhibitors (BLBLI) class of antibiotics, results of susceptibility of B. fragilis isolates to piperacillin/tazobactam, Ticarcillin - clavulanate, and Ampicillin - sulbactam, showed that only 6.6% of the isolates were resistant for both piperacillin/tazobactam and Ampicillin - sulbactam while they were fully susceptible (100%) for Ticarcillin - clavulanate. Among the 15 B. fragilis isolates tested, 13 (86.6%) were found to be β - lactamase producers, by changing color of the nitrocefin filter paper to reddish - orange within a range from a few seconds to 15 minutes, whereas 13.3% of the isolates showed no such result. When comparing results of nitrocefin test with those of antibiotic disc diffusion test, results showed that the nitrocefin positive of B. fragilis isolates were resistant to most of the antimicrobials tested. Among 15 isolates, 6 (40%) isolates showed high OD value and dark purple colour (high biofilm producer), 5 (33.3%) showed moderate biofilm - producer, 3 (20%) showed weak biofilm producer, while only one isolate (6.6%) was non - biofilm producer. When comparing results of biofilm with those of antibiotic disc diffusion test, it was found that the high biofilm producers of B. fragilis isolates (No. 1, 5,6,10,12 and 14) were resistant to most of the antimicrobials tested. This study also showed that all high biofilm producers of B. fragilis isolates (No. 1, 5, 6, 10, 12 and 14) were highly resistant to Ampicillin, Amoxicillin, Cefoxitin, Cefotetan, Cefotaxime, Ceftriaxone and Clindamycin while non - biofilm producers of B. fragilis isolate (No. 1) was highly sensitive to all antibiotics used in this study. Also found that high biofilm producers of B. fragilis isolates (No. 1, 5, 6, 10, 12 and 14) were sensitive to Ampicillin - sulbactam, Tricarcillin - clavulanate, Piperacillin/tazobactam, Imipenem, Meeropenem, Ertapenem, Doripenem, Moxifloxacin and Metronidazoles.
