دراسة التنوع الوراثي لضروب مختلفة من الفلفل الحلو Capsicum annuum L. لعينات من الاسواق المحلية باستعمال بعض التقانات الوراثية الجزيئية == Genetic diversity study for different varieties of sweet pepper Capsicum annuum L. for samples from local markets by using some molecular genetic techniques
Author name:
شيماء صباح مهدي
Supervisor name:
احسان عرفان حسين
General topic:
Biology
Specific topic:
Plant - Genetics
Degree:
Doctorate
University:
University of Baghdad
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3353 - p.pdf
Abstract:
درس التباين الوراثي في 22 عينة محلية ومستوردة من ثمار الفلفل الحلو Capsicum annuum L. التي جمعت من الاسواق المحلية العراقية باستعمال بعض المعلمات الجزيئية ، فضلا عن تعيين تركيز مادة الكاروتينات Carotenoids في ثمار الفلفل الحلو باستعمال تقانة الكروماتوغرافيا السائلة عالية ا لاداءHigh - performance liquid chromatography (HPLC)، كما كشف عن ثلاثة من الجينات المسؤولة عن انتاج هذه المادة وهي Lycopene β - cyclase (Lcyb)، β - carotene hydroxylase (Crtz - 2) وCapsanthin - capsorubin synthase (Ccs) مع اجراء التسلسل التتابعي للدنا DNA sequencing لهم.درس التباين الوراثي باستعمال تقانة عديد التكوين ذات القطعة الطولية المضخمةAmplified fragment length polymorphism (AFLP) ولثلاثة توافقات بين البوادئ المستعملة في جميع العينات. انتج التوافق الاول EACG/MAGG اربعة حزم في عينات الفلفل المدروسة وبعدد ثلاثة حزم احادية الشكل Monomorphic bands في كل عينة، ما عدا عينتي الفلفل الاردني البرتقالي والاحمر التي انتجت اربع حزم في كل عينة كانت واحدة منها متعددة الاشكال Polymorphic bands وبنسبة مئوية 25% وكانت كفاءة التوافقPrimer efficiency 21.43% مع قوة فعالية تميزية Discriminatory power بنسبة 100%. انتج التوافق الثاني EAAG/MAAT اربعة حزم في كل عينة كانت جميعها احادية الشكل ولم تظهر اية حزمة متعددة الاشكال وكانت كفاءة التوافق 28.57% مع قوة فعالية تميزية بنسبة 0%، بينما انتج التوافق الثالث EACA/MCTG سبعة حزم في كل عينة كانت جميعها احادية الشكل، ماعدا عينة الفلفل الاخضر العراقي/بلد قد انتج ثلاثة حزم وكانت ايضا احادية الشكل ولم تظهر اية حزمة متعددة الاشكال وكانت كفاءة التوافق 50% مع قوة فعالية تميزية بنسبة 0%. رسمت شجرة القرابة الوراثية باستعمال معامل Jaccard للتشابه الوراثي وتوزعت العينات ضمن التحليل العنقودي في ثلاثة مجاميع رئيسة. المجموعة الاولى ضمت ثمار الفلفل الحلو الاردني الاحمر والبرتقالي، بينما المجموعة الثانية فقد ضمت الفلفل العراقي/بلد الاخضر والمجموعة الثالثة فتكونت من عينات ثمار الفلفل الحلو الاخرى. لقد اوضح هذا المخطط وجود تشابه عال بين ثمار الفلفل الحلو الاردني الاحمر والبرتقالي مع عينات الفلفل الاخرى ما عدا الفلفل العراقي/بلد الاخضر وبنسبة 0.94 وهي اعلى قيمة تشابه, بينما كانت قيمة التشابه مع عينة الفلفل العراقي/بلد الاخضر بنسبة 0.68. اظهرت النتائج ايضا بان اعلى قيمة بعد وراثي بين عينتي ثمار الفلفل الحلو الاردني الاحمر والبرتقالي وعينة الفلفل العراقي/بلد الاخضر وبقيمة 2.236. استعملت في دراسة تقانة تكرار التسلسل البسيط Simple Sequence Repeat (SSR - PCR) ستة بوادئ، وان هذه البوادئ قد انتجت 33 حزمة كان منها 24 حزمة متعددة الاشكالPolymorphic bands، بينما كان تسعة حزم منها احادية الشكل Monomorphic bands. رسمت شجرة القرابة الوراثية باستعمال معامل Jaccard للتشابه الوراثي، وبينت النتائج بان العينات قد توزعت ضمن التحليل العنقودي في عشرة مجاميع رئيسة. لقد اوضحت النتائج وجود تشابه عال بين ثمار الفلفل الحلو العراقي/بلد واليوسفية الاخضر وبنسبة 1 وهي اعلى قيمة تشابه بالمقارنة مع اقل قيمة تشابه لعينة الفلفل الاسباني الطويل الاخضر وبقيمة 0.35. نسبة التشابه العالية قد ظهرت ايضا بين ثمار الفلفل الحلو الاردني الاصفر والاحمر وبقيمة 0.98 وكذلك بين ثمار الفلفل الحلو العراقي/صويرة الاخضر وثمار الفلفل الحلو الايطالي الاخضر وبقيمة 0.94. اظهرت النتائج ايضا بان اعلى قيمة بعد وراثي بين عينتي ثمار الفلفل الحلو العراقي/بلد الاخضر والفلفل العراقي/يوسفية الاخضر وعينة الفلفل الايراني البرتقالي وبقيمة 5.656، بينما كان اقل بعد وراثي بين عينتي ثمار الفلفل الحلو الاردني الاخضر والاصفر، اذ كانت القيمة مساوية الى 1.0. استعملت في تقانة الدنا متعدد الاشكال المضخم عشوائياRandom amplified polymorphic DNA (RAPD - PCR) خمس بادئات عشوائية، وكانت نسبة التعدد الشكلي لجميع البوادئ 100% مع ظهور حزمة متميزة واحدة وبحجم جزيئي 1800 زوج قاعدة عندما استعمل البادئ C52، بينما لم تنتج البادئات الاخرى اية حزم متميزة. نتائج شجرة القرابة الوراثية التي رسمت بالاعتماد على معامل Jaccard للتشابه الوراثي قد وزعت العينات ضمن التحليل العنقودي الى ثمان مجاميع رئيسة. اظهرت شجرة القرابة وجود تشابه عال بين ثمار الفلفل الحلو العراقي/اليوسفية الاخضر وثمار الفلفل الحلو الاردني الاصفر بنسبة 0.84 وهي اعلى قيمة تشابه، بالمقارنة مع تشابه وبقيمة صفر بين ثمار الفلفل الحلو الايراني الاصفر وبين عينات ثمار الفلفل الحلو الاخرى. اظهرت قيم البعد الوراثي بين عينات ثمار الفلفل الحلو المدروسة اعلى قيمة كانت بين عينتي ثمار الفلفل الحلو الصيني الاصفر والايراني الاخضر وبقمة 5.0، بينما كان اقل بعد وراثي بين عينتي ثمار الفلفل الحلو الاسباني الاخضر والايطالي الاصفر، اذ كانت القيمة مساوية الى 1.0. قدر اعلى تركيز للبيتا - كاروتين في عينة الفلفل الايطالي الاصفر وبقيمة 1415.73 مايكروغرام/مليلتر بالمقارنة مع اقل قيمة التي هي 94.32 مايكروغرام/مليلتر في الفلفل الايراني الاخضر. كانت اعلى قيمة في الفلفل الاصفر في العينة الايطالية واقل قيمة للون نفسه كان في عينة الفلفل الايراني الاصفر وبقيمة 710.89 مايكروغرام/مليلتر، اما اعلى تركيز للبيتا - كاروتين للفلفل البرتقالي فكان في العينة الايطالية وبقيمة 898.5 مايكروغرام/مليلتر بالمقارنة مع 574.33 مايكروغرام/مليلتر في الفلفل الايراني البرتقالي. الفلفل الاحمر قد سجل اقل قيمة لتركيز البيتا - كاروتين وهي 245.27 مايكروغرام/مليلتر في عينة الفلفل الاردني الاحمر، بينما سجل الفلفل الاسباني الاحمر اعلى قيمة وهي 435.41 مايكروغرام/مليلتر. الفلفل الاخضر قد سجل اعلى قيمة في عينة الفلفل الايطالي وبقيمة 232.43 مايكروغرام/مليلتر بالمقارنة مع قيمة 98.86 مايكروغرام/مليلتر في عينة الفلفل العراقي/صويرة الاخضر. كشف عن بعض الجينات التي لها علاقة بتصنيع البيتا - كاروتين باستعمال تقانة Polymerase chain reaction (PCR)، وباستعمال الترحيل الكهربائي لهلام الاكاروز بتركيز 2%. وجد الجين Lcyb في 11 عينة فلفل مدروسة عند الكشف عنه باستعمال البوادئ الخارجية External primers، بينما اظهر الترحيل الكهربائي قطعة مضخمة في 19 عينة فلفل حلو مدروسة وبحجم 360 زوج قاعدة عندما استعملت البوادئ الداخلية Internal primers. وجد الجين Crtz باستعمال البوادئ الخارجية في عينة الفلفل العراقي/صويرة الاخضر وبحجم جزيئي اكبر من 1500 زوج قاعدة، بينما اظهر الترحيل الكهربائي قطعة مضخمة في 3 عينات هي الفلفل الاردني البرتقالي، والفلفل العراقي/يوسفية الاخضر والفلفل الايراني الاخضر وبحجم 760 زوج قاعدة عندما استعملت البوادئ الداخلية. وجد الجين Ccs باستعمال البوادئ الخارجية في عينة الفلفل العراقي/صويرة الاخضر والفلفل الايطالي البرتقالي وبحجم جزيئي اكبر من 1500 زوج قاعدة، بينما اظهر الترحيل الكهربائي قطعة مضخمة في 7 عينات اخرى من ثمار الفلفل الحلو وبحجم 490 زوج قاعدة عندما استعملت البوادئ الداخلية. بينت نتائج التسلسل التتابعي لقطعة من الجين Lcyb في بعض من عينات الفلفل الحلو الاخضر الى وجود تشابه كبير بين التسلسلات التتابعية لقطعة الجين المدروسة والتسلسل التتابعي القياسي Refseq للجين نفسه، مع وجود بعض الاختلافات لبعض القواعد النايتروجينية بين العينات المدروسة. وجدت اعلى قيمة تشابه بين التسلسلات التتابعية في عينات الفلفل الحلو المدروسة بين عينة الفلفل العراقي/الصويرة الاخضر وبين عينة الفلفل الايراني الاخضر وبقيمة 0.903، بينما اقل قيمة تشابه فقد وجدت بين عينة الفلفل الاردني الاصفر وعينة الفلفل الصيني الاصفر وبقيمة 0.539. بينت نتائج التسلسل التتابعي لقطع الجين Crtz وجود نوعين من التغيرات الجينية هي الحذف Deletion والاستبدال Substitution في الفلفل الاردني البرتقالي. لقد كان هناك استبدال القاعدة النايتروجينية الكوانين G بالقاعدة النايتروجينية الثايمين T في الموقعين 846 و850، واستبدال القاعدة النايتروجينية الثايمين T بالقاعدة النايتروجينية السايتوسين C في المواقع 852، 860 و861، كذلك كان هناك استبدال القاعدة النايتروجينية السايتوسين C بالقاعدة النايتروجينية الادنين A في الموقعين 856 و862 واستبدال القاعدة النايتروجينية السايتوسين C بالقاعدة النايتروجينية الثايمين T في الموقعين 864 و870. طفرات الحذف ايضا كانت موجودة، اذ حذفت القواعد النايتروجينية ATA من قطعة الجين Crtz في عينة الفلفل الاردني البرتقالي بالمقارنة مع التسلسل التتابعي القياسي Refseq. بينت نتائج التسلسل التتابعي لقطعة من الجين Ccs في بعض من عينات الفلفل الحلو الاخضر الى وجود تشابه كبير بين التسلسلات التتابعية لقطعة الجين المدروسة والتسلسل التتابعي القياسي Refseq للجين نفسه، مع وجود بعض الاختلافات لبعض القواعد النايتروجينية بين العينات المدروسة، كما ان هناك بعض طفرات الاستبدال قد حدثت. وجدت اعلى قيمة تشابه بين التسلسلات التتابعية في قطع الجين Ccs بين عينة الفلفل الايطالي البرتقالي وبين عينة الفلفل الايطالي الاخضر وبقيمة 0.966، بينما اقل قيمة تشابه فقد وجدت بين عينة الفلفل العراقي/بلد الاخضر وعينة الفلفل الايطالي الاخضر وبقيمة 0.611. | Genetic variation was studied in 22 local and imported samples of bell pepper fruits Capsicum annuum L., which collected from local Iraqi market by using some molecular markers. Estimation of carotenoids by using high - performance liquid chromatography (HPLC) was done in all samples. Detection of three genes; Lycopene β - cyclase (Lcyb), β - carotene hydroxylase (Crtz - 2) and Capsanthin - capsorubin synthase (Ccs), were also studied and the DNA sequencing was done for these genes.Amplified fragment length polymorphism (AFLP) was studied for three selective amplification primers in all samples. The first selective amplification primer (EACG/MAGG) produced 4 bands for the studied bell pepper fruits with 3 monomorphic bands in each sample, except the orange and yellow Jordanian bell pepper samples, which produced 4 bands one of them polymorphic band with 25% ratio and 21.43% primer efficiency with 100% discriminatory power. The second selective amplification primer (EAAG/MAAT) produced 4 monomorphic bands in each sample with no polymorphic bands with 28.57% primer efficiency and 0% discriminatory power, whereas the third selective amplification primer (EACA/MCTG) produced 7 monomorphic bands in each sample, except the Iraqi/Balad green bell pepper, which produced 3 monomorphic bands with no polymorphic bands and the primer efficiency is 50% with 0% discriminatory power. The results of Dendrogram of the studied samples by using Jaccard coefficient for genetic similarity was distributed the samples into 3 main groups. The first group was included the red and orange Jordanian bell pepper fruits samples, whereas the second group included the Iraqi/Balad green bell pepper and the third group included the rest samples. The results of this distribution revealed a high similarity between red and orange Jordanian bell pepper and the other bell pepper samples, except Iraqi/Balad green bell pepper with 0.94 values. This value is the higher, whereas the similarity with the Iraqi/Balad green bell pepper is 0.68 values. The genetic distance between studied samples revealed the highest values between red and orange Jordanian bell pepper and the Iraqi/Balad green bell pepper with 2.236 values. Six primers were used with single sequence repeat (SSR - PCR) technique. These primers produced 33 bands. The number of polymorphic bands is 24, whereas the number of monomorphic bands is 9. The results of Dendrogram of the studied samples by using Jaccard coefficient for genetic similarity was distributed the samples into 10 groups. This Dendrogram revealed a higher similarity between Iraqi/Balad green bell pepper and Iraqi/Yousifia green bell pepper with 1 value. This value is the highest between samples in comparison with lowest values (0.35), which are found in Spanish long green. There are another high values were revealed between Jordanian yellow and red bell pepper with 0.98 value. Also, other high similarity values revealed between and Iraqi/ Souwyera green bell pepper and Italian green bell pepper with 0.94 values. The genetic distance between the studied samples revealed the highest values between Iraqi/Balad and Yousifia green bell pepper with Iranian orange bell pepper with 5.656 values, in comparison with the lowest genetic distance between Jordanian green and yellow bell pepper with 1.0 value. The random amplified polymorphic DNA (RAPD - PCR) was used five randomly primers. The percentage of polymorphic bands is 100%, with one distinguished band which is produced by using C52 primer with 1800 base pair. The other primers did not produce any distinguished band. The results of Dendrogram of the studied samples by using Jaccard coefficient for genetic similarity was distributed the samples into 8 groups. This Dendrogram revealed a higher similarity between Iraqi/Yousifia green bell pepper and Jordanian yellow bell pepper with 0.84 values. This value is the highest between samples in comparison with lowest values (0.0) which are found between Iranian yellow bell pepper and the other samples. The genetic distance between studied samples revealed the highest values between Chinese yellow bell pepper and Iranian green bell pepper with 5.0 values, in comparison with the lowest genetic distance between Spanish green bell pepper and Italian yellow bell pepper with 1.0 value. The higher value of β - carotene concentration was found in Italian yellow bell pepper sample with 1415.73 µg /ml, in comparison with 94.32 µg /ml, which is estimated in Iranian green bell pepper. The highest concentration values of β - carotene in yellow bell pepper was found in Italian sample, in comparison with the lowest value for the same color, which found in Iranian yellow bell pepper with 710.89 µg /ml. The highest concentration value of β - carotene in orange bell pepper was found in Italian sample with 898.5 µg/ml, in comparison with 574.33 µg/ml in Iranian orang bell pepper sample. The red bell pepper was estimated lowest concentration of β - carotene with 245.27 µg/ml in Jordanian red bell pepper, in comparison with highest value in Spanish red bell pepper with 435.41 µg/ml. The green bell pepper was estimated highest concentration of β - carotene in Italian green bell pepper with 232.43 µg/ml, in comparison with lowest value with 98.86 µg/ml in Iraqi/Souwyera green bell pepper sample. Some of genes which related with β - carotene production were detected in all samples by using Polymerase chain reaction (PCR), and the products produced by this approach were resolved on 2% agarose gels. The Lcyb gene was detected in 11 bell pepper samples by using the external primers, whereas the gel electrophoresis for this gene revealed amplified band with 360 base pair in 19 bell pepper samples when internal primer was used. The Crtz gene was detected in Iraqi/ Souwyera green bell pepper sample with amplified band more than 1500 base pair by using the external primers, whereas the gel electrophoresis for this gene revealed amplified band with 760 base pair in 3 bell pepper samples; Jordanian orange bell pepper, Iraqi/ Yousifia green bell pepper and Iranian green bell pepper when internal primer was used. The Ccs gene was detected by using the external primers in Iraqi/ Souwyera green bell pepper and Italian orange bell pepper with amplified band more than 1500 base pair, whereas the gel electrophoresis for this gene revealed amplified band with 490 base pair in 7 bell pepper samples when internal primer was used. The DNA sequences results for the Lcyb gene in some green bell pepper samples revealed high similarity between its nucleotides and Refseq for the same gene, with some differences in nucleotide sequences for some bell pepper samples. The highest similarity between nucleotide sequences was found between Iraqi/Souwyera green bell pepper sample and Iranian green bell pepper sample with 0.903 value, whereas the lowest similarity was found in Jordanian yellow bell pepper and Chinese yellow with 0.539 value. The nucleotide sequences results for the Crtz gene revealed two types of genetic changes, such as deletion and substitution in Jordanian orange bell pepper. The results found substitution in the guanine (G) nucleotide base with thymine (T) nucleotide base in 846 and 850 positions. Also, substitute the thymine nucleotide base with the cytosine (C) nucleotide base in the 852, 860 and 861 positions. Substitution also found in the cytosine nucleotide base with adenine (A) nucleotide base in the 856, 862 position, and substitute the cytosine nucleotide base with the thymine nucleotide base in the 864 and 870 positions. Deletions of nucleotide bases was also found like ATA sequence in the Crtz gene of Jordanian orange bell pepper in comparison with the standard nucleotide sequence (Refseq) for the same gene. The nucleotide sequences results for the Ccs gene in some bell pepper samples revealed high similarity with the standard nucleotide sequence (Refseq) for the same gene with some differences in some nucleotide bases of the studied samples, like substitution. The highest similarity between nucleotide sequences for the Ccs gene was found between Italian yellow and green bell pepper samples with 0.966 values, whereas the lowest similarity was found in Iraqi/Balad green bell pepper with 0.611 values.
