تاثير مستخلص نبات ورق الغار واللاكتوفيرين على تكوين الغشاء الحيوي لبكتريا Proteus mirabilis المعزولة من المرضى حاملي انابيب القثطرة == The effects of Laurus nobilis leaf extract and lactoferrin on the formation of Proteus mirabilis biofilm in patients with urinary catheters
Author name:
نور شكيب محمد
Supervisor name:
ضمياء محمود ابراهيم
General topic:
Biology
Specific topic:
Life Science
Degree:
Master
University:
Mustansiriyah University - Faculty Of Basic Education
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3447 - p.pdf
Abstract:
هدفت هذه الدراسة الى عزل وتشخيص بكتريا Proteus mirabilis من قثاطـر المجاري البولية، وتم التحري عن بعض عوامل الضراوة (الغشاء الحيوي، الحركة المتموجة، ومقاومة المضادات الحيوية)، وكذلك دراسة تاثير بعض المنتجات (المستخلص الكحولي لورق الغار، واللاكتوفيرين) على عوامل الضراوة، ومن ثم دراسة جزيئية - وراثية لعامل الضراوة Fimbriae.جمعت (110) عينة ادرار من قثاطر المجاري البوليةCatheter من المرضى الراقدين في وحدة العناية المركزة في مستشفيات بغداد (مستشفى الجراحات البولية المتعددة/ مدينة الطب)،(مستشفى ابن القف لاصابات الحبل الشوكي ومستشفى الكندي التعليمي) للفترة من تشرين الاول/2013 ولغاية اذار/2014.زرعت عينات الادرار على وسط اكار الدم والماكونكي ووسطCLED agar Cysteine Lactose Electrolyte Deficient ، ثم اخضعت المزارع البكتيرية النامية الى الفحوصات المجهرية والكيموحيوية لغرض تشخيص بكترياProteus mirabilis ، وتم تاكيد التشخيص باستعمال عدة التشخيص الخاصة بالعائلة المعوية Vitek2 ، شخصت (14) عزلة باستعمال البطاقات GNI - Cards Gram Negative Identifecation الخاصة بجهازVitek2 والعزلات الستة شخصت بـ Analytic Profile Index API.اوضحت نتائج العزل والتشخيص ان هناك (82) عينة موجبة للزرع البكتيري بنسبة(74.5%) اما العينات السالبة للزرع البكتيري فكانت (28) عينة بنسبة (25.5%) ، تواجدت بكترياProteus spp في (20) عينة ادرار بنسبة (24.4%) وكانت بكترياProteus mirabilis تمثل (20) عزلة بنسبة (100%).تم التحري عن تاثير المضادات الحيوية في العزلات البكتيرية باستعمال بطاقةAST - Cards Antibiotics Sensitivity Tests اذ بينت النتائج تباين في مقاومة العزلات للمضادات الحيوية العشرين المختارة. فكانت جميع العزلات قيد الدراسة مقاومة بنسبة (80 - 90%) لكل من المضادات(Ampicillin - Piperacillin - Ticarcillin) ومقاومة بنسبة (70%) للمضادCeftazidime ونسبة(65%) للمضادCeftriaxone و(50%) للمضادCefepime ، ونسبة(35.7%) لكل من Ciprofloxacin وAztreonam ، اما بالنسبة للمضادات (Minocycline - Tigecycline - Nitrofurantoine) فكانت نسبة المقاومة (100%)، اما المضاد Trimethoprim فكانت نسبة المقاومة (85.7%) يليه مضادGentamycin بنسبة (78.5%)،ومضادTobramycin بنسبة(71.4%)، وAmikacin بنسبة(28.5%) ومن ثم مضادLevofloxacin بنسبة(14.2%)، فيما كانت العزلات جميعها حساسة بنسبة (100%) لمضاد Imipeneam، كما اظهرت العزلات مقاومة متعددة للمضادات الحيوية عندما قاومت (7 - 14) مضاد حيوي بنسبة (64.3%).اظهرت (20) عزلة من بكترياProteus mirabilis قابليتها على تكوين الغشاء الحيوي بنسبة ( (%100ولكن بدرجات متفاوتة، اذ اظهرت(10) عزلات وبنسبة(50%) انتاجية عالية للغشاء الحيوي، في حين كانت العزلات الاخرى ذات انتاجية واطئة للغشاء الحيوي.تم التحري عن قابلية العزلات ذات الانتاجية العالية للغشاء الحيوي للمقاومة المتعددة للمضادات الحيوية. وتبين من خلال النتائج ان العزلة P11 قد ابدت مقاومة الى (13) مضاد حيوي لتشكل اعلى نسبة مقاومة متعددة للمضادات (65%) في حين كانت اقل نسبة مقاومة (20%) وهي للعزلة P20 التي قاومت (4) مضادات.حضرت تراكيز متعددة من المستخلص الكحولي لورق الغار اذ تم اختبار تاثيره على العزلات البكتيرية (20) قيد الدراسة، لوحظ ان التركيز(200 ملغم/ مللتر) اعطى اعلى منطقة تثبيط (20ملم) بينما التركيز(6.25 ملغم/ مللتر) اعطى اقل منطقة تثبيط (10ملم). تم اختبار تاثير اللاكتوفيرين على عشرين عزلة من بكترياProteus mirabilis اذ بينت النتائج ان التركيز (200ملغم/ مللتر) اعطى منطقة تثبيط (7ملم) وكان هذا قبل عملية التنافذ الغشائي ، اما بعد عملية التنافذ الغشائي وتركيز حجمه الى النصف اعطى منطقة تثبيط (15ملم).تم تحديد التراكيز المثبطة الدنياMIC والتراكيز المثبطة لتكوين الغشاء الحيويBIC لكل من المستخلص الكحولي لورق الغار واللاكتوفيرين، اظهرت النتائج ان التركيز المثبط الادنى للمستخلص الكحولي لورق الغار واللاكتوفيرين كان (6.25, 100 ملغم/مللتر) على التوالي، اما التركيز المثبط لتكوين الغشاء الحيوي للمستخلص الكحولي واللاكتوفيرين كان (100,200 ملغم/ مللتر) على التوالي.تم اختبار تاثير تركيزBIC لكل من المستخلص الكحولي لورق الغار واللاكتوفيرين لتثبيط التصاق الغشاء الحيوي لبكترياProteus mirabilis بطريقة اطباق المعايرة الدقيقة، تراوحت نسبة التثبيط بين (8 - 43%) بالنسبة للمستخلص الكحولي لورق الغار، اما بالنسبة للاكتوفيرين فتراوحت نسبة التثبيط بين (18 - 59%).اعتمدت التراكيز المثبطة لتكوين الغشاء الحيويBIC لكل من المستخلص الكحولي لورق الغار واللاكتوفيرين في اختبار تثبيط التصاق الغشاء الحيوي في انابيب القثطرة لبكترياProteus mirabilis وكذلك لعدة انواع من البكتريا السالبة لصبغة كرام المعزولة من قثاطر المجاري البولية، حيث اظهرت النتائج ازالة واضحة للغشاء الحيوي من على انابيب القثطرة عند النظر اليها بالعين المجردة والمقارنة بالسيطرة.اختيرت خمس عزلات لبكترياProteus mirabilis والتي اعطت انتاجية عالية للغشاء الحيوي لغرض دراسة جزيئية وراثية للكشف عن عوامل الضراوة المسؤولة عن تكوين الغشاء الحيوي، حيث اعتمدت تقنيةPCR كوسيلة لايضاح احد اهم عوامل الضراوة وهي الاهلاب Fimbriae المسؤولة عن التصاق البكتريا على سطوح الاغشية الطلائية للمجاري البولية وعلى سطوح انابيب القثطرة التي تؤدي الى تكوين الغشاء الحيوي، اظهرت النتائج ان العزلات الخمسة التي تم اختيارها كانت جميعها تمتلك جينPMF (pmf A) المسؤول عن التشفير للاهلابFimbriae ، حيث ان حجم البادئ كان 618 للعزلات الخمسة حيث تم ترحيلها بنفس مسار الدليل الحجمي للقطعة600 واعطت نتيجة موجبة بنسبة (100%). | The aim of this study is to isolate and diagnose Proteus mirabilis bacteria from urethral catheters; some virulence factors were investigated such as : - biofilm, swarming movement and resistance to antibiotics. The effect of Lactoferrin solution and the alcoholic extract of Laurus nobilis on these virulence factors was investigated, then a molecular genetic study was performed to the some factors(fimbriae).110 urinary sample were collected from urethral catheters of patients who had admitted to the intensive care units in 3 hospitals in Baghdad(Surgical subspecialities hospital/ Medical city, Al - Kindy teaching hospital & Ibn Al - Kuff hospital) during the period between October 2013 & March 2014.Those urine samples were cultured using Blood agar media, MaCconkey agar media& CLED agar media, the colonies of the growing bacteria underwent microscopial & chemobiological examination to diagnose Proteus mirabilis , the diagnosis was confirmed using the diagnostic kit specific for enterobacteriacae Vitek 2; 14 strains were diagnosed using GNI cards and 6 others were diagnosed using API.The results of isolation &diagnosis revealed 82 positive samples in bacterial culture (74.5%) while negative samples were 28(25.5%). Proteus spp. Was present in 20 urinary samples (24.4%) and Proteus mirabilis represented 20 strains (100%).The effect of antibiotics on bacterial strains was investigated using AST - card and the results revealed differences in the resistance of strains to the 20 chosen antibiotics.All studied strains were resistant in 80 - 90% to Ampicillin, Piperacillin & Ticarcillin, 70% to Ceftazidime , 65% to Ceftriaxone, 50% to Cefipime,and 35.7% to Ciprofloxacin & Aztreonam, whereas the resistance to minocycline, tigecycline & Nitrofuratoin was 100% .The resistance to trimethoprim was 85.7%, to gentamycin was 78.5%, to amikacin was 28.5% and 14.2% to Levofloxacin.At the same time , all strains were sensitive to imipineam , while some strains have shown multidrug resistance to 7 - 14 antibiotics (64.3%).The 20 strains of Proteus mirabilis have shown an ability to form biofilm in a rate of 100% but with variable degrees. The Biofilm was highly produced by 10 strains (50%), the other 10 strains have shown low ability to produce the biofilm.The 10 strains with high rate of biofilm production were selected & compared according to the number of resisted antibiotics, the results have shown a highest rate of resistance (65%) in P11 strain as it was resistance to 13 antibiotics , whereas the P20 strain has shown the lowest rate of resistance (20%) as it was resistant to 4 antibiotic only.Multiple concentrations of alcoholic extract of Laurus nobilis were prepared & their effect on the studied dacteria strains was investigated. It was noticed that the concentration of 200 mg/ml had given the highest area of inhibition (20 mm) , while the concentration of 6.25 mg/ml had given the lowest area of inhibition (10 mm).The effect of lactoferrin solutio on the 20 strains of Proteus mirabilis was investigated and the results revealed that the concentration of 200 mg/ml had given an area of inhibition of 7 mm before performing solution dialysis whereas after dialysis and decreasing volume to the half, the area of inhibition increased to 15 mm.The minimal inhibitory concentration (MIC) , & the biofilm inhibitory concentration for both of alcoholic extract of Laurus nobilis & lactoferrin solution were quantified , and the results have shown that MIC of alcoholic exract of Laurus nobilis & lactoferrin was 6.25 & 100mg/ml respectively whereas BIC of alcoholic extract & lactoferrin was 100 & 200 mg/ml respectively.The effect of BIC of both alcoholic exract & lactoferrin on the inhibition of adhesion of biofilm of Proteus mirabilis was investigated using microtiter plate method , the rate of 18 - 59% for lactoferrin solution. The BIC of both alcoholic extract of Laurus nobilis & lactoferrin solution were adopted in investigating the inhibition of adhesion into catheter tubes of Proteus mirabilis and other types of gram negative bacteria isolated from urethral catheters.Five strains of Proteus mirabilis were selected according to their high rate of production of biofilm , for molecular & genetic study to discover the virulence factors responsible for biofilm production. PCR technology was used to demonstrate one of the most important virulence factors which is (fimbriae) responsible for bacterial adhesion on the surfaces of lining epithelium of urinary tract and catheter tnbes which leads to biofilm production . The results have shown that all the selected five strains had PMF gene which is responsible for fimbriae encoding , were the volume of primer was (618 bp) for all the five strains ; the five strains have given a positive results (100%) in the same path of ladder of band (600bp) when examined by electrophoresis
