في نماذج عنق (HPV) التنميط الجيني للفيروسي الحليمي البشري الرحم لنساءعراقيات باستخدام تقنيتي الوقت الحقيقي - سلسلة تفاعل البلمرة والصفوف الجينية == Genotyping of Human Papillomavirus in a sample of Iraqi women with cervical abnormalities by using Real - Time PCR and Macroarray
Author name:
حلى يونس فاضل السعدي
Supervisor name:
ضحى سعد صالح | فيصل غازي ناصر
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Viruses
Degree:
Doctorate
University:
University of Baghdad
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3064 - p.pdf
Abstract:
هدفت الدراسة الحالية التحري عن العلاقة بين اصابة الفيروس الحليمي البشري (HPV) وحالات الخلايا غير الطبيعية لعنق الرحم في النساء العراقيات. تضمنت الدراسة 122امراة لديهن اعراض سريرية لاصابة عنق الرحم, 110 امراة منهن تميزت بنمو الخلايا غير الطبيعية لعنق الرحم او السرطانية, حيث كان 40.9 % من تلك النساء كان لديهن اصابة بالفيروس الحليمي البشري, اما 12(16.7%) امراة المتبقية تميزت بنمو الخلايا الطبيعية لعنق الرحم بالرغم من وجود التهاب مزمن والتي جمعت خلال عام 2010. تضمنت مجموعة السيطرة 10 نساء والتي تميزت بغياب كل من التغيرات الخلوية, العلامات السريرية والاصابة بالفيروس الحليمي البشري. اظهرت نتائج مسحات عنق الرحم وجود نوعين من خلايا عنق الرحم غير الطبيعية هي : اصابة الخلايا الطلائية الداخلية الحرشفية قليلة الخطورة (LSIL) التي شملت 70% من حالات الاصابة بالفيروس, واصابة الخلايا الطلائية الداخلية الحرشفية عالية الخطورة (HSIL) التي شملت 26% من حالات الاصابة الايجابية. بينما 4% من مجموع الاصابة الكلية تمثلت بالنساء ذو الخلايا الطبيعية لعنق الرحم والالتهاب المزمن . هي الصفة المميزة للاصابة بالفيروس. تلك الصفة ترافقت مع 100% بوجودKoilocytosisالثاليل التناسلية الظاهرة للعيان و16.7% ترافقت مع الثاليل المستوية (غير الظاهرة). تشير دراسة الدنا الفيروسي باستعمال تجربتي سلسلة تفاعل البلمرة - الوقت الحقيقي(PCR RealTime) والصفوف الجينية(MacroArrays) التي طبقت لاول مرة في العراق الى وجود الفيروس الحليمي البشري بنسبة 35.6% في كل المجاميع المدروسة. تشير النتائج الى وجود 17 نمط جيني مختلف للفيروس الحليمي البشري بين 47 امراة مصابة باستعمال تقنية الصفوف الجينية, اربعة عشر من هذه الانماط الجينية كانت من الانماط عالية الخطر والتي شكلت 82.35% من مجموع الانماط والانماط الجينية المتبقية كانت من الانماط قليلة الخطر والتي شكلت 17.56% من مجموع الانماط. دى النتائج المهمة للدراسة الحالية تشير الى وجود 10 انماط جينية مختلفة ربما سجلت للمرة الاولى في النساء العراقيات ( 31 - , 45 - , 51 - , 52 - , 53 - , 58 - , 59 - , 66 - , 68 - , 44 - HPV ). لنمط الجيني 16 - HPV هو السائد على الانماط الجينية السبعة عشر, شكل هذا النمط مع الانماط الجينية (59 - , 39 - , 66 - , 6 - HPV) الانماط الخمس الاكثر شيوعا في العينات الموجبة. كما اظهرت الدراسة بان النساء ذوات الخلايا الطبيعية لعنق الرحم والمصابة بالفيروس تحمل الانماط الجينية 16 - HPV و59 - HPV. كما شخصت سبعة انماط جينية مختلفة في عينات الثاليل التناسلية الظاهرة وهي (16 - , 6 - , 11 - , 39 - , 59 - , 66 - , 44 - HPV ). اشارت النتائج الى ان 32 (68.09%) من بين 47 امراة مصابة كانت لديهن الانماط عالية الخطر فقط, سواء كانت الاصابة بانماط مفردة او متعددة, بينما ثمان نساء (17.2%) كان لديهن الانماط عالية وقليلة الخطر سوية, وسبع نساء (14.89%) كان لديهن الانماط قليلة الخطر فقط. استعمل المجهر الالكتروني النافذ للتحري عن الجزيئات الفيروسية في عشر عينات موجبة للدنا الفيروسي وذو تغيرات خلوية مختلفة, حيث اظهرت النتائج وجود الجزيئات الفيروسية في ست عينات بمستويات مختلفة من المرضى واربع عينات لم تظهر جزيئات فيروسية. استخدمت تجربة التحول اللمفاوي لتقييم الحالة المناعية للمصابين. حيث وجدت نسبة التحول عالية في النساء ذوات الخلايا الطبيعية في عنق الرحم والمصابة بالفيروس (اصابة كامنة), بينما انخفضت نسبة التحول اللمفاوي في النساء ذوات الخلايا غير الطبيعية في عنق الرحم . امتلكت 40% تقريبا من حالات الثاليل التناسلية معدل عالي للتحفيز التكاثري للخلايا التائية عند مقارنتها بمجموعة السيطرة. اضافة الى ذلك كان التحفيز التكاثري للخلايا التائية مستقلا احصائية عن كل من نوع الاصابة, المحتوى الفيروسي والمجاميع العمرية. استخدمت تجربة تفاعل سلسلة البلمرة - الوقت الحقيقي للكشف عن الفيروس وكميته لثلاثة عشر نمط جيني الاكثر ترددا بين المستويات المختلفة للنمو غير الطبيعي للخلايا الطلائية لعنق الرحم في الحالات : قبل الاورام, الاورام والسيطرة الاصحاء(132 عينة). اظهرت نتائج فحص سلسلة البلمرة بان 35 حالة موجبة من 47 حالة اصابة فيروسية التي شملت 74.5% من مجموع الاصابات الكلية. بينما الحالات المتبقية (12 حالة ) التي مثلت 25.5% من مجمو الاصابات الكلية لم يكشف عنها بهذه التقنية. لذلك قدر عدد نسخ الدنا الفيروسي لاغلب الانواع الفيروسية عالية الخطرفي 33 عينة موجبة بمستويات مختلفة من التغيرات الخلوية وعينتين موجبتين ذوات خلايا طبيعية لعنق الرحم . توزع المحتوي الفيروسي ل 33 عينة اعلاه من 1×10 الى 9.4×106 نسخة /مل بمعدل (4.17×104 نسخة /مل). اما العينتين المتبقيتين كانتا خارج قيم المنحى القياسي لذا قدرت ب 5× 107 و1×109 نسخة /مل تقريبا. صنف المحتوى الفايروسي لل35 عينة اعلاه كالاتي : 46% من العينات كمحتوى فيروسي عالي, 34% كمحتوى فيروسي منخفض و20% كمحتوي فيروسي متوسط. استخدم اختبار الصفوف الجينية لفحص 68 عينة, 36 عينة منها كانت موجبة و32 عينة كانت سالبة باختبار سلسلة تفاعل البلمرة - الوقت الحقيقي. حيث وجدت الانماط الجينية عالية الخطر باستعمال هذه التقنية في (36/35) 97% من العينات الموجبة, بينما العينة المتبقية كانت سالبة لفحص الصفوف الجينية. كما وجدت الانماط الجينية قليلة الخطر وعالية الخطر المحتمل في تلك 35 عينة الموجبة والتي لم يكشف عنها فحص تفاعل سلسلة البلمرة - الوقت الحقيقي فهي الانماط (6 - , 11 - , 53 - , 66 - HPV). اما فيما يخص العينات السالبة في فحص تفاعل سلسلة البلمرة - الوقت الحقيقي حيث فحصت باستعمال اختبار الصفوف الجينية ووجدت الانماط الجينية في 12 عينة منها, الانماط هي : (44 - , 66 - , 53 - , 11 - , 6 - , 58 - , 39 - HPV). تبين مما تقدم بان فحص الصفوف الجينية يتحرى عن 8 انماط جينية لا يكشف عنها فحص تفاعل سلسلة البلمرة - الوقت الحقيقي, تلك الانماط شكلت 32.84% من تردد الانماط و33.33% من الحالات الموجبة التي تمتلك عدة انماط وهذا يعكس العامل المهم الذي يفضل فحص الصفوف الجينية في التحري عن الفيروس. لذا يبدو اختبار الصفوف الجينية طريقة دقيقة واكثر حساسية لكشف وتنميط اصابات الفيروس الحليمي البشري مقارنة مع فحص تفاعل سلسلة البلمرة - الوقت الحقيقي. | The present study was conducted to investigate the relationship between Human papillomavirus (HPV) infection and cervical cytological abnormalities in Iraqi women. One hundred twenty two women were included in this study with a cervical infection. A sample of 110 women with abnormal cytology cervical dysplasia / cancer, 45 of which 40.9% had HPV infection and 12 (16.7%) women had chronic infection with normal cytology during 2010. A control group with 10 women of normal cytology and no HPV infection was included in study for comparison. Pap smear test results showed two types of cervical cytological abnormalities, low squamous intraepithelial lesion (LSIL) which comprised of 70% of HPV positive cases, and high squamous intraepithelial lesion (HSIL) which comprised of 26% of HPV positive cases. Whereas 4 % out of the total risk group was represented in women with normal cytology. Koilocytosis is pathognonomic for HPV infection. Furthermore, Koilocytosis was accompanied with 100% with genital wart presence and 16.7% was accompanied with flat wart presence. HPV - DNA studied using Real - Time PCR and MacroArray assay (GenoArray) which applied for the first time in Iraq indicates the presence of HPV - DNA in 35.6% of all tested groups. Results indicate the presence of 17 different HPV genotypes among 47 infected women by using macroarray technique. Fourteen of these HPV genotypes which comprised of 82.35% were high risk (HR - type) and 17.56% (3/17) were low risk (LR - type).One of the important results in the present study indicates the presence of ten different genotypes which may be recorded for first time in Iraqi women (HPV - 31, - 44, - 45, - 51, - 52, - 53, - 58, - 59, - 66 and - 68 types). Out of 17 genotypes HPV - 16 was the predominant one, this genotype together with genotypes 59, 6, 39 and 66 comprised of the five most common types detected in HPV positive cases. Moreover, percentage of HPV - 16, and - 59 were extended to involve women with normal cytology. Seven different genotypes - 6, - 11, 16, 59, - 39, - 66 and - 44 have been identified in genital wart specimens. Results indicated that 32 (68.09%) out of 47 infected women had HR type alone, whether single or multiple types, while eight women (17.02%) had HR types in association with LR types and seven women (14.89%) had LR type only. Transmission electron microscope (TEM) was used for viral particles detection from ten HPV DNA positive samples with different cytological changes. Results indicated the presence of viral particles in six samples with different grades of disease and four samples showed no viral particles. To evaluate the immune status of patients lymphocyte transformation assay was applied. Results indicated that transformed lymphocyte were found to be high in women with normal cytology which may have HPV as a latent infection, while they were decreased in women with abnormal cytology. Approximately 40% of genital wart cases have higher mean of proliferative T cell response when they were compared with control group. However, proliferative T cell responses were statistically independent on HPV infection type, viral load and aging group. Real - time PCR assay was employed for HPV detection and quantitation (viral load estimation) from the range of HR - HPV DNA 13 genotypes most frequently found in different grades of cervical intraepithelial neoplasia, cervical tumors and health controls from (132 samples). Results showed that out of 47 positive cases 35 cases can be detected by real - time PCR which comprised of 74.5%. Failures in detection by this technique included 12 cases which comprised of 25.5% of the positive samples. Therefore, viral DNA copies number for the most HR - HPV types in cervical samples was determined from 35 sample with low and high - grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN I, II, III and Squamous Cell Carcinoma), and with normal cytology. However, the viral load of the 33 samples spread over a wide range from 1×10 to 9.4×106 copies/ml (mean 4.17×104 copies/ml). In addition, two samples were around the standard curve values as : approximately 5×107 and 1×109 copies/ml considered. Viral load was estimated approximately 46% constituted as high viral load, 34% as low viral load and 20% as slightly high viral load. Macroarray was applied in 68 samples, 36 of which were positive and 32 were negative by the real - time PCR test. High - risk genotypes were found in 35/36 (97%) real - time PCR positive samples, whereas remaining two samples were negative for HPV DNA (false - positive) by macroarray assay. The low - risk and probable high - risk (PHR) HPV genotypes were detected in the 35 HPV - positive samples which are not detected by real - time PCR included genotypes : HPV - 6 (in three samples), - 11, - 53 and - 66 (in two samples for each). HR, PHR and LR HPV genotypes were detected by macroarray in the 11/31 HPV - negative samples in real - time PCR which comprised of genotypes : - 39, - 58, - 66, - 11, - 6 and - 44. The GenoArray (GA) is capable of detecting 21 HPV multiple genotypes, including 8 types not detecting in real - time PCR. These types represented 32.84% of HPV types frequency and 33.33% of HPV positive cases had multiple types, this may reflect the important factor potentially favoring the GA for HPV detection. Therefore, the GA genotyping assay appears to be more accurate and sensitive technique for the detection and genotyping of HPV infections than real - time PCR one.
