التداخل البكتيري مع عوامل ضراوة خميرة الكانديدا المسببة لحالات التهاب الفرج والمهبل == Bacterial Interference In The Virulence Factors Of The Yeast Candida Causing Vulvovaginal Candidiasis
Author name:
ايمان ناطق ناجي البياتي
Supervisor name:
احسان شفيق توفيق دميرداغ | سناء مسلم الصفار
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Doctorate
University:
Mustansiriyah University - College Of Science
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3214 - p.pdf
Abstract:
جمعت 200 عينة من اعالي المهبل ( H.V.S ) High Vaginal Swab من نساء متزوجات توزعت بين 130 امراة غير حامل ( Non Pregnant Women ) ( NPW ) منهـن 90 كن مصابات بالتهاب الفرج والمهبل Vaginitis و( 40 ) منهن كن سليمات لغرض السيطرة (H ) Healthy Control والباقــي ( 70 ) عينة من نساءحوامل ( P.W. ) Pregnant Women ، منهـن( 40 ) امراة مصابة بالتهاب الفرج والمهبل و( 30 ) اخرى سليمـة سيطرة . استمرت فترة جمع العينات من 1/6/2002 الى 1/2/2003 تحت اشراف الكادر الطبي المتخصص في قسم النسائية والتوليد في مستشفى النعمان العام في الا عظمية / بغداد . كما تم تخصيص استمارة استبيان لكل مريضة دون فيها كل ما يخص المريضة من اعراض سريريه ونتائج التشخيص والفحص المختبري والملاحظات العامة .اعتمادا على الاعراض المرضية والفحوصات المختبرية التشخيصية تم تحديد ثلاث انواع من الالتهابات المهبلية وهي : ا - التهاب الفرج والمهبل اللانوعيBacterial Vaginosis (BV.) ..ظهرت الحالة في (23) مريضة من مجموع (70) امراة حامل [ فيهن (40) مريضة و( 30) اخرى سليمة ] بنسبة (33%) من الحوامل ، كما ظهرت في ( 25) امراة غير حامل من مجموع ( 130) امراة [فيهـن ( 90 ) مريضة ] بنسبة ( 19% ) من النساء غير الحوامل .ب - التهاب الفرج والمهبل الكانديدي Volvavagianal Candidiasis (VVC) .. ظـهرت الحالة في ( 13) مريضة من مجموع ( 70) امراة حامل بنسبة ( 18%) [فيهن ( 30) امراة سليمة و( 40) اخرى مريضة ] كما ظهرت في ( 43) مريضة من مجموع ( 130) امراة غير حامل بنسبة (33%) [فيهن ( 40) امراة سليمة و(90) اخرى مريضة جـ - التهاب ناتج من اصابة مختلطة Mixed Infection (MI) ظهرت الحالة في ( 4) مريضات من مجموع ( 70) امراة حامل بنسبة (6% ) [ فيهن ( 30) امراة سليمة و(40) اخرى مريضة] كما ظهرت في (22) مريضة من مجموع (130) امراة غير حامل بنسبة ( 17) [ فيهن (30) امراة سليمة و(40) امراة اخرى مريضة] . وقد تم عزل 74 عزلة من خميرة الكانديدا عزلت ( 38 ) عزلة منهـن( 43 ) امراة مصابة بالكانديـدا ( VVC ) عزلت ( 16 ) عزلة من (22) مريضة مصابة باصابة مختلطة (M.I ) وعـزلت ( 5 ) عزلات من مجمـوعة السيطرة من النساء غير الحبلى ومن جانب اخـر عزلت ( 11 ) عزلة من ( 13 ) امراة مصابة بالكانديدا ( VVC ) و( 3 ) عزلات من 4 نساء مصابات اصابة مختلطة ( M.I ) وعزلة واحدة من مجموعة السيطرة للنساء الحوامل. وهذه النتائج تدل على سيادة خميرة الكانديدا في التهاب الفرج والمهبل لدى مجموعتي النساء الحوامل وغير الحوامل.و تم تشخيص الانواع التالية من خميرة الكانديدا وهي : Candida albicans ( 37 عزلة ) ، C. tropicalis ( 20 عزلة ) C. glabrata ( 7 عزلات) C.dubliniensis ( 7 عزلات ) وC.parapsilosis عزلة واحدة وC. krusei عزلتين. امكن الحصول على 588 عزلة بكتيرية من مجموع عدد الحالات الموجبة للزرع البكتيريولوجي لمجموعتي المرضى والسيطرة البالغ عددهم ( 140 ) امراة شخصت فيها سبعة اجناس من البكتيريا اللاهوائية والانواع التابعة لها وهي : Peptostreptococcus spp, Peptococcus spp, Prevotella spp , Streptococcus spp, Bacceroides spp, Propionibacterium spp, Lactobacillus spp, كما تم تشخيص انواع من البكتريا المتحملة لوجود كميات قليلة من الاوكسجين وهي : Strept . mitis , Entero , faecalis , Gardnerella vaginalis اضافة الى اربع اجناس وبعض انواعها من البكتريا الهوائية وهي Proteus spp , Staphylococcus spp , Escherichia spp, Pseudomonas spp .ولقـد كان النوعان G.vaginalis , Bacteroides fragilis من اكثر الانواع عزلا في مجموعتي النساء الحوامل وغير الحوامل المصابات بالتهاب الفرج والمهـبل اللانوعي B.V . وفيما يخص عوامل الضراوة لخميرة الكانديدا والانواع التابعـــة لها وجد ان 28 عزلة ( 76 % ) منتجة للانزيم الحال للشحوم المفسفرة Phospholipase و6 عزلات ( 16 % ) ضعـيفة الانتاجية لهـذا الانـزيم و( 3 ) عزلات ( 8 % ) غير منتجة من اصل ( 37 ) عزلة للنوع C. albicans اماعزلات C. tropicalis فكانت 15 عزلة ( 75 % ) منتجة للانزيم و3 عزلات ( 15 % ) ضـعيفة الانتاجية وعزلتان ( 10 % ) غير منتجة من اصل 20 عزلة . اما عزلات النوع C.dubliniensis فكانت منـها ( 5 ) عزلات ( 71% ) منتجة من اصل (7) عزلات فى حين انتجت عزلة واحدة للنوع C.glabrata هذا الانزيم .وعند دراسة انتاج الانزيم الهاضم للبروتينات Proteinases كعامل اخر من عوامل الضراوة فقد تباينت قدرة الانزيمات المنتجة مـن عزلات الكانديدا على هظم البروتيــن بين ( 175 - 30 ) مكغم / مل وتفاوتت العزلات في قابليتها على انتاج الانزيم فكانت هناك 29 عزلة منتجة من اصل 74 عزلة كانديدا وكانت ( 7 ) منـها مـن النوعC.albicans و( 8 ) منها للنـوع C. tropicalis , وثلاث منها للنوع C. dubliniesis وعـزلة واحـدة للنـوع C. glabrata ولم تتمكن عزلات النوعين الاخرين من انتاج الانزيم وهما C.parapsilsosis وC. krusei . ومن حيث عامل الضراوة الثالث وهو قدرة الخميرة على الالتصاق بالخلايا الطلائية فقد تفاوتت ايضا عزلات الخميــرة فـــي اظهار هـــذه القدرة وكان النوعان C. albicansوC. dubliniensis هما الاكثر كفاءة في الالتصاق من بين الانواع الاخرى وكانت نسبة خلايا الخميرة الملتصقة بالخلايا الطلائية في درجة الحرارة 25 م اعلى من التي حصلت عند درجة 37 م للعزلة نفسها ولكن التحليل الاحصائي لم يظهر فروقا معنوية عالية .كانت جميع عزلات خميرة الكانديدا مقاومة لمادة النستاتين وبتراكيز عالية جدا بلغت 256 مكغم / مل في حين كان المستحضر Clotrimazole هـو الافضل مـن بين مشتقات الازول الاخرى اذ كانت جميع العزلات حساسة له فقـد تراوحت قيـم (MIC ) بيـن ( 2 - 125, 0) مكغم / مل للنوعين C.albicans , C.tropicalis و( 0.5 - 0,125) للنوعين C.dubliniensis وC.glabrata وكانت قيم MFC اكبر او تساوي 4 مكغم / مل . بينـما تفاوتت حساسية عزلات الخميرة اتجاه مشتقات الازول الاخرى اذا اظهرت ثلاثة انواع من الخميرة مقاومة لمضاد Ketoconazule وهي C. albicans , C.dubliniensis , C. glabrata اذ تراوحت قيم MIC ( 0.5 - 32 )،( 0.25 - 16 ) , 160.25 - - مكغم / مل على التوالي بينما كانت الانواع الثلاثة الاخرى حساسة له . وكانت قيم MFC على العموم اكبر ويساوي 32 مكغم / مل . وكانت جميع العزلات حساسـة لمضاد Miconazole اذ تراوحت قيم ( MIC ) مـن ( 4 - 8 ) مكغم / مـل ضد النوع C. albicans واقلها هـــي للنوع C.dubliniensis وهي (0.125 - 1.0) مكغم / مـل بينما كانت قيمة MFC تتراوح بين اكبر او يساوي 4 الى اكبر او تساوي 16 حسب نوع العزلة . وكانت قيم MIC للمضاد Fluconazole مرتفعة لكنها لم تتجاوز 32 مكغم / مل ولذا اعتبرت العزلات حساسة ولكن بتراكيز عالية بينما كان MFC له اكبر او يساوي 64 .كانت قيم MIC لمضاد Amphotericin B هــي الافضل اذا بلغت (0,125 - 0,5 ) مكغم / مل اما MFC فكان يساوي 1 مكغم / مل لقد اظهرت النتائج ان طريقة التخافيق باستعمال الوسط الزرعي السائل لتحديد MIC هي الافضل مقارنة باستعمال الوسط الزرعي الصلب اذ كانت قيم MIC مرتفعة مقارنة بقيم MIC بالطريقة الاولى .ولدراسة الفعالية التضادية لبعض انواع البكتريا المعزولة من اعالي المهبل على عوامل الضراوة وحيوية خميرة الكانديدا ، انتخبت 32 عزلة بكتيرية تابعة لاجناس مختلفة على اساس ما اظهرته من تاثير تضادي في التجارب الاولية على عوامل الضراوة او الحيوية او كلاهما وهذه العزلات هي ثلاث عزلات تابعة للنوع Peptostreptococcus prevotii ، ثلاث عزلات تابعة للنوع propianibacterium granulosum، وست عزلات تابعة للنوع Lactobacillus acidophilus وخمس عزلات تابعة للنوع L. gensenii وثلاث عزلات لكل من النوعين Streptococcus mitis وEnterococcus faecalis كما وانتخبت عزلات الخميرة الاكثر كفاءة في التجارب قيد الدراسة واعتمادا على نتائج الجزء السابق .بعد ان نميت العزلات البكتيرية السابقة الذكر في اوساط زرعية مناسبة لكل منها تم الحصول على رواشح مزارعها السائلة وتم تركيز الرواشح الــى نصف الحجم ( رم 1) والى ربع الحجم ( رم 2 ) مع الاحتفاظ بجزء من الراشح غير المركز . لم تظهر الرواشح غير المركزة تاثيرا على هذه العوامل ولقد بدا واضحا تاثير الراشح المركز لمرة واحدة او لمرتين وبدرجات متفاوته وذلك لاختلاف الاجناس البكتيريا والانواع التابعة لها . كانت اكـثر الـرواشح تاثيرا هـي الـرواشح المركزة م1 وم 2 لكـل مـن العزلات Sm3 , Ef3 , Lj5 , La5 , La6 على فعالية الخميرة في انتاج الانزيمات الهاضمة للبروتين والانزيمات الحالة للشحوم المفسفره وكان النوع C. albicans اكثر حساسية اتجاه المعاملة بهذه الرواشح مقارنة مع الانواع الاخرى ، كما اثرت هذه الرواشح على خفض نسبة الانبات في المصل وبفرو قات معنوية كبيـرة وصلت الى >0.001 P . واظهر ( رم1 ) ( رم2 ) للعزلة La 6 تاثيرا في خفض حيوية الخميرة مقدرة بوحدة مستعمرة لكل مل ( CFU/ml ) وتبين ان لحموضة هذه الرواشح تاثيرا في عملية التثبيط ولكن لا يعزى له التاثير الكلي. فعند مقارنة تاثير الحموضة فقط فـــي اوساط زرعيه سائلة ذات pH محدد ومماثل الى pH الرواشح مما يشير الى ان هذه الرواشح تحتوي مركبات ذات تاثير مثبط ، كما لم تظهر رواشح العزلات الاخرى تاثيرا واضحا او كان بعضها غير مؤثر . ولمحاولة فهم طبيعة تاثير خلايا العزلات البكتيرية السابقة على عملية التصاق خميرة الكانديدا بسطوح الخلايا الطلائية وجدنا ان العزلات Lj5 , La5 , Pp3 , Pg3 , Sm3 , Ef3 , La6 هي الاكثر تاثيرا في خفض نسبة الالتصاق وعلى التوالي وقد اظهرت العزلات طرقا مختلفة في طبيعة منع الالتصاق اما باحاطة خلايا الخميرة بغلاف من خلايا البكتريا او باحاطة الخلية الطلائية بغلاف من خلايا البكتريا او كلاهما مما يمنع التصاق الخميرة بسطح الخلية الطلائية وذلك من خلال غلق المستقبلات على سطوح الخلايا. | 200 high vaginal swabs were taken from 200 married women, 130 of them were non - pregnant (N.P) and 70 were pregnant (P.) women. Of the 130 N.P : 90 were suffering from vaginitis and 40 were healthy controls. Of the pregnant group 40 were suffering from vaginitis and the rest 30 were healthy controls. Thus there were a total of 130 infected and 70 healthy. Sample were taken during the period of first of June 2002 till the end of Feb. 2003, under the supervision of specialized gynecologist in the general No’man hospital in Adhamia , Baghdad . A special questionnaire was prepared for each individual. As result of cultural and microbiological examinations of the sample and depending on the clinical and microbiological features of the 130 infected pregnant (90) and non - pregnant (40) women their vaginitis were devided into three groups, namely : (a) : Bacterial vagnosis (B.V) : Appeared in (23) out of (70) pregnant women [ including (30) healthy and (40) infected i.e. 33% ]B.V. also appeared in 25 non - pregnant women out of 130 [ including (40) healthy and (90) infected i.e. 19% ](B) : Volavaginal condidiasis (V.V.C).Appeared in 13 women out of (70) pregnant women ( 18%) [including 30 healthy and (40) sick] it V.V.C also appeared in (43) infected non - pregnant women out of 130 ( 33%)[ including (40) healthy and (90) sick](C ) : Volvavaginosis due to mixed bacterial and fungal infection. I.e. mixed infection (M.I) : Appeared in (4) patient out of (70) pregnant women (6%) [including 30 healthy and (40) sick women ] . It also appeared in (22) patients out of (130) non - present women [including (40) healthy and (90) sick pregnant women] A total of (74) isolates of candida SPP were isolate from non pregnant and pregnant women of this number 38 isolates from (43) VVC non pregnant cases, (16) isolates from 22 MI non pregnant cases, 5 isolates from 40 healthy non pregnant group, 11 isolates from 13 VVC pregnant women, 3 isolates from 4 MI pregnant women, and one isolates from 30 healthy.The following species of Candida were identified : C. albicans 37 isolates , C. tropicalis 20 isolates , C. glabrata 7 isolates , C. dubliniensis 7 isolates , C. parapsilosis one isolate , and C. kursei 2 isolates .Bacteriologically 588 isolates of bacteria were obtianed form 140 women positive for bacterial cultural ; these include several species of 7 anaerobic bacterial genera ; peptostreptococcus, peptococcus , Streptococcu spp, prevotella spp, Bacteroides spp, lactobacillus spp and propionibacterium spp. Similarly the following microaerophilliic bacteria were isolated; Gardnnerella vaginalis, Enterococuus faecalis , and Streptococcus mitis . The following aerophilic were also isolated, staphyllococcus spp, proteus spp Escherichia spp and pseudomonas spp. the most frequently isolated species a mong infected women group with ( B.V) were Bacteriodes fragilis and G. vaginals . Concerned the virulence factors of the yeast candida spp like production of phospholipases and proteinasas, besides the adherence on epithelial cells ( from human mouth ) and drug tolerance. Phpspholipase was produced by 28 isolates (76 %) out of 37 of C. albicans whereas the rest 6 isolates (16 %) were weak producers and 3 isolates (8 %) did not produce this enzyme. On the other hand out of 20 isolates of C. tropicalis 15 (75 %) were weak producer and 2 isolates (10 %) were not producers of the enzyme . Of The 7 isolates of C. dubliniesis 5 (71% ) could produce the phospholipase also one ( 14 % ) of the 7 isolated of C.glabrata could produce theis enzyme . The enzyme proteinase was produced by 29 out of 74 (39 %) isolated of candida spp out these 17 were C.albicans 8 were C. tropicalis , 3 were C. dubliniesis , one was C. glabrata the other species did not produce the enzyme. Ability of the isolates for attachment onto the surface of epithelial cells varied according to the species. Both C.albicans , C. dubliniesis were more efficient than other species . The percentage of epithelial cells attached by yeast cells were higher at 25C than at 37 C for the same isolate of the yeast, though this difference was not significant. As the resistance to antifungals concerned, we found that all isolates of candida were resistant to nystatin . The measured minimum inhibitory concentration (MIC) reached 256 g/ml . On the other hand , all isolates of candida were much more susceptible to clotrimazole with MIC ranging ( 0,125 - 2 ) g/ml for C.albicans and C. tropicalis and about ( 0,5 - 0.125 ) g / ml for C.dubliniesis and C.glabrata . The minimum fungicidal concentration (MFC) was 4 ug/ml or more for these Candida spp .The (MIC) for ketocanazole against C. albicans , C.dubliniesis , C.glabrata ranges were [0.5 - 32, 0.25 - 16 and 0.25 - 16] g / ml respectively, whereas the other species of candida were more sensitive to ketaconzole , and the ( MFC ) generally was equal to or higher than 32 ug / ml .The (MFC) for Miconzole was (4 - 8) g / ml against C. albicans an (1 - 0.125) g / ml agianst C.dubliniesis , the ( MFC ) ranged between equal to or higher than 4 and 16 g / ml . Fluconzole was less effctive than the others as the (MIC) values agianst all species were 32 g / ml or les. While the (MFC) was equal to or higher than 64 g / ml. Amphoterricin B was the most effective as the (MIC) values against all isolates of candida were (0.125 - 0.5) g / ml and MFC was 1 g/ ml.For the determination of (MIC) we found that using serial dilution of liquid cultures was better than using solid agar media. The recorded (MIC) result using agar media were higher than those obtained in liquid media.We studied the antagonistic effect against virulence factors of Candida spp by (23) isolates of bacteria isolated from healthy vagina. The selection of the candida and the bacterial isolates based on preliminary tests. So three isolates of peptostreptococuus prevotii, three isolates of propionibacteriume granulosum, six isolates of lactobacillus acidophilus , five isolates of lactobacillus jensenii , three isolates of each of streptococcus mitis , and Enterococcus feacalis were used in such tests as culture filtrates and / or as bacterial cells.The cultural filtrates were concentrated to the half or to the quarter volume of the original, as the non - concentrated culture filtrates did not show any effect. Different filtrates showed different levels of effect, the more effective were the double or quadruple concentrates of the culture filtrates of L.acidophilus isolates no 5 and 6, L.jensenii isolates No. 5, Enter.faecalis isolates No. 3 and strep.mitis isolates No. 3 . These filtrates adversely affected the phospholipase and proteinase enzymes, C.albicans being more affected than other species. Also these filtrates reduced significantly (P < 0.001) the percentage of germ forming cells of C.albicans . The culture filtrate (conc. to half or to quarter volume) of isolate No. 6 of L.acidophilus greatly reduced the viability (CFU /ml) of C.albicans and other species. This effect was not totally due to the acidity (low pH) since similar pH values in control tests did not reduce viability to the same level and did not effect the yeast cells. We found that adhesion of candida cells to epithelial cells was reduced in the presence of bacterial cells. The following bacteria were effective and they are listed below starting from the most to the less effective in reducing the number of adhering yeast cells (the number refers to the isolate number L.acidophilus 6, Enter. feacalis 3, Strep. mitis 3, P.granulosum3 peptost. prevotii 3 , L.acidophilus 5 and L.jensenii 5 .Some species of bacteria prevented adhesion by surrounding the yeast cells while other species surrounded the epithelial cells some did both
