عزل ودراسة انزيمي كلوتاميت ديهيدروجينيز وكلوتامين سنثيتيز من مرضى سرطان خلايا الكلى وعلاقتهما بمسـتوى بعـض المتغيرات الكـيموحـيوية في الدم == Isolation and Studying of Glutamate Dehydrogenase and Glutamine Synthetase from Renal Cell Carcinoma Patients and It’s Relationships with Some Biochemical Parameters in Blood
Author name:
محمود احمد محمد فخري
Supervisor name:
طارق يونس احمد مصطفى
General topic:
Chemistry
Specific topic:
Analytical Biochemistry
Degree:
Doctorate
University:
University of Al Mosul - College Of Science - Chemistry Department
Language:
Arabic
University location:
Mosul
First pages:
25T1627 - p.pdf
Abstract:
يتضمن البحث دراسة انزيمي كلوتامين سنثيتيز وكلوتاميت ديهيدروجينيز وبعض المتغيرات الكيموحيوية لاشخاص مصابين بسرطان خلايا الكلى ومقارنتها مع اشخاص اصحاء (سليمين ظاهريا) حيث تم جمع (19) عينة نسيج كلى مصاب بسرطان خلايا الكلى مع اخذ عينة دم قبل اجراء العملية الجراحية لاستئصال الورم وبعدها .واظهرت الدراسة وجود زيادة معنوية في فعاليتي كلوتامين سنثيتيز وكلوتاميت ديهيدروجينيز في مصل دم مرضى سرطان خلايا الكلى عند مقارنتها مع الاشخاص الطبيعيين، كما ظهرت زيادة معنوية في البروتين الكلي الكلوبيولين ، اليوريا ، الكرياتينين ، النحاس، كلوتاميت اوكزالواستيت امينو ترانسفريز ، كلوتاميت بايروفيت امينو ترانسفريز ، لاكتيت ديهيدروجينيز والفوسفاتيز القاعدي ولوحظ وجود انخفاض معنوي في تركيز الالبومين، فيتامين C والخارصين في مصل دم الاشخاص المصابين بسرطان خلايا الكلى .واظهرت النتائج ايضاﹰ وجود زيادة معنوية بين فعالية كل من كلوتامين سنثيتيز وكلوتاميت ديهيدروجينيز وتركيز البروتين في انسجة الكلى المصابة عند مقارنتها مع الانسجة السليمة ، ولوحظ وجود علاقة ارتباط معنوية موجبة بين فعالية كلوتامين سنثيتيز في نسيج الكلى ومصل الدم للاشخاص المصابين بسرطان خلايا الكلى، ولم يلاحظ وجود علاقة ارتباط معنوية لفعالية كلوتاميت ديهيدروجينيز في نسيج الكلى ومصل الدم للاشخاص المصابين وكذلك الحال مع تركيز البروتين. كما تبين وجود علاقة ارتباط معنوية بين فعالية كلوتامين سنثيتيز وكلوتاميت ديهيدروجينيز مع فعالية اللاكتيت ديهيدروجينيز في مصل دم الاشخاص المصابين بسرطان خلايا الكلى. ويلاحظ زيادة نسبة الاصابة بسرطان خلايا الكلى مع تقدم العمر ، التدخين ، السمنة ، كما تزداد نسبة الاصابة في الذكور وكذلك في الاشخاص المتزوجين ، كما لوحظ انخفاض معنوي في فعالية الانزيمات ومستوى المتغيرات في مصل الدم بعد اجراء العملية الجراحية عدا الالبومين وفيتامين C والخارصين، حيث تزداد بعد العملية .كما تم عزل كلوتامين سنثيتيز وكلوتاميت ديهيدروجينيز من نسيج كلى سليم واخر مصاب بسرطان خلايا الكلى باستخدام التقنيات الحياتية المختلفة الترسيب بكبريتات الامونيوم، الفرز الغشائي والترشيح الهلامي باستخدام هلام Sephadex G - 200 , Sephadex G - 75 .ومن خلال استخدام تقنية الهجرة الكهربائية الحاوية على Sodium dodecyl sulfate تبين ان الوزن الجزئي التقريبي للوحدة الفرعية للكلوتامين سنثيتيز المعزول من نسيج الكلى السليم والمصاب متشابه وبحدود (42,600 Da) وكذلك الوزن الجزيئي التقريبي للوحدة الفرعية للكلوتاميت ديهيدروجينيز المعزول من نسيج الكلى السليم والمصاب متشابه وبحدود (53,900 Da) .ومن خلال دراسة الظروف المثلى لقياس فعالية كلوتامين سنثيتيز المنقى جزئيا من نسيج الكلى السليم ، تبين ان الانزيم يعمل في ظروف مثلى باستخدام المحلول المنظم Imidazole - HCl بتركيز (mM 100) وبدالة حامضية ( 7.2) ودرجة حرارة (45 C°) و15 mM)) من الكلوتاميت كمادة اساس، وبلغت قيمة ثابت ميكيلس والسرعة القصوى للانزيم باستخدام رسم لاينويفر - برك (mM 11.97) و(0.0818 U/ml) على التوالي ، ودرس تاثير تركيز كلوريد الامونيوم وادينوسين - 5 - ثلاثي الفوسفات على فعالية كلوتامين سنثيتيز وكان التركيز الامثل لكل منها (1 mM) و(4 mM) على التوالي , وبلغت قيمة السرعة القصوى لهما (0.065 U/ml) و(0.0609 U/ml) على التوالي بينما بلغت قيمة ثابت ميكيلس لهما (0.419 mM) و(1.64 mM) على التوالي باستخدام رسم لاينويفر - برك .كما اشارت الدراسة من خلال دراسة الظروف المثلى لقياس فعالية كلوتاميت ديهيدروجينيز المنقى جزئيا من نسيج الكلى السليم ، ان الانزيم يعمل في ظروف مثلى باستخدام المحلول النظم Tris - HCl بتركيز (100 mM)وبدالة حامضية (8.8) ودرجة حرارة (°40 C) و(50 mM) الكلوتاميت كمادة اساس ، وبلغت قيمة ثابت ميكيلس والسرعة القصوى للانزيم باستخدام رسم لاينويفر - برك (29.5 mM) و(0.6916 U/ml) على التوالي ، ودرس تاثير تركيز نيكوتين امايد ادينين ثنائي النيوكليوتيد على فعالية كلوتاميت ديهيدروجينيز وكان التركيز الامثل له (4 mM) ، وبلغت قيمة ثابت ميكيلس والسرعة القصوى لنيكوتين امايد ادينين ثنائي النيوكليوتيد (0.91 mM) و(0.424 U/ml) على التوالي | The research included studying glutamine synthetase, glutamate dehydrogenase and some biochemical parameters of (19) of renal cell carcinoma patients in comparison with control .The results showed a significant increase of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase activity in serum of patients, a significant increase in total protein, globulin, urea, creatinine, copper, glutamate pyruvate aminotransferase, glutamate oxaloacetate aminotransferase, lactate dehydrogenase, alkaline phosphatase, and a significant decrease in albumin, zinc and vitamin C .The study also showed a significant increase in glutamine synthetase, glutamate dehydrogenase and protein in tumor compared to normal kidney’ s tissue .Correlation study was performed between the measured biochemical parameters and glutamine synthetase, glutamate dehydrogenase. The results predicted that there were positive correlation between glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase with lactate dehydrogenase in serum. Also positive correlation between glutamine synthetase in serum with tissue, and no correlation between glutamate dehydrogenase, protein concentration in serum with tissue .The study also predicted that there was risk factors affecting on renal cell carcinoma disease such as age, sex, smoking, obesity, nutrition and martial status .The results also indicated that there were a significant decrease in enzymes activity and the levels of some biochemical parameters in serum after surgery except albumin, zinc and vitamin C .The research also concerned with isolation of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase from tumor and normal kidney tissues using different biological techniques. These included : ammonium sulfate precipitation, dialysis, gel filtration chromatography on sephadex G - 75 and sephadex G - 200 .Further more, the comparative molecular weight of the subunit of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase were determined by sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide electrophoresis techniques for tumor & normal kidney tissue and found to be (42,600 Da) and (53,900 Da) respectively .The results also showed that the optimum conditions of glutamine synthetase were obtained using imidazole - HCl (100 mM) as a buffer at pH (7.2), (45 C°) and (15 mM) of glutamate as a substrate. Using Linweaver - Burk plot, it was found that Vmax and Km have the values of (0.0818 U/ml), (11.97 mM) respectively. The effect of ammonium chloride and Adenosine - 5́ - triphosphate concentration on the enzyme activity were also preformed. The optimum concentration of ammonium chloride is (1 mM) with Vmax (0.065 U/ml)and Km (0.419 mM). On the other hand, the optimum concentration of Adenosine - 5́ - triphosphate is (4 mM) with Vmax (0.0609 U/ml) and Km (1.64 mM) .Finally, The optimum conditions of glutamate dehydrogenase were obtained using Tris - HCl (100 mM) as a buffer at pH (8.8) , (40 C°) and (50 mM) of glutamate as a substrate. Using Linweaver - Burk plot, it was found that Vmax and Km have the values of (0.6916 U/ml), (29.5 mM) respectively. The effect of nicotinamide adenine dinucleotide concentration on the enzyme activity was also preformed. The optimum concentration of nicotinamide adenine dinucleotide is (4 mM) with Vmax (0.424 U/ml) and Km (0.91 mM) .
