استخلاص وتنقيـةlecithinase من بكتريا Proteus vulgaris ودراسة بعض تاثيراته الممرضه == Extraction and purification of Lecithinase from Proteus vulgaris and study some it is pathogenic effects
Author name:
زهراء عباس جبر العيساوي
Supervisor name:
رسمية عبد ابو ريشة
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
University of Baghdad
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3146 - p.pdf
Abstract:
جمعت 162 عينة ادرار ومسحات جروح من المرضى المصابين بالتهابات المجاري البولية واصابات الجروح لكلا الجنسين للفترة من ايلول 2009 ولغاية شباط 2010. شخصت العزلات اعتمادا على الصفات المظهرية والفحوصات البايوكميائية ووجد ان 55 عزله تعود الى جنس Proteus وبنسبه عزل 33,9% كما وجد ان 5 عزلات تعود الى النوع Proeus vulgaris وبنسبه عزل 9,09% بعدما شخصت باستخدام نظام Api20E . حددت قابلية عزلات النوع Proeus vulgaris على انتاج انزيم lecithinase باستخدام طريقة الانتشار في الاكار. وجد ان اربع عزلات منتجة للانزيم وان العزلةProteus vulgaris (P1) هي الامثل في الانتاج. استخلص الانزيم من هذه العزلة وتم تنقيته باستخدام عملية الترسيب بكبريتات الامونيوم بنسبه تشبع 60% والتنقية باستخدام عمود الهلام sephacryl S - 200 حيث ظهرت قمتين بروتينية وتم قياس الفعالية النوعية للانزيم بعد التنقية حيث وجد انها تساوي 217 وحدة /ملغم وبتركيز بروتين 290,%ملغم/مل . درس تاثير عدد من المضادات الحيويه على انتاجية وفعالية الانزيم ووجد ان بعض المضادات تثبط انتاج الانزيم مثل اموكسلين / حامض كلافيولانك اسد ,ارثرومايسين وجنتمايسين وبتراكيز 60, 260 , 10 مايكروغرام/مل على التوالي بينما وجد ان البنزاثين بنسلين والريفامبين لايؤثر على الانتاجية ووجد ان الريفامبين يؤثر على فعالية الانزيم بتركيز 80مايكروغرام/ مل. حددت قابلية الانزيم السمية حيث درس التاثير القاتل للنصف للانزيم LD50)) في الحيوانات المختبرية ووجد ان نسبة الجرعة القاتلة للنصف تساوي 210 مايكرو غرام/مل كما حددت نسبة الجرعة المسببة لاصابة الكلى لنصف الحيوانات المختبرية KID50 ووجد ان النسبة تساوي 82,5 مايكروغرام/مل. كما درست التاثيرات النسجية التي يسببها الانزيم في اعضاء الحيوانات المحقونة والتي شملت اعضاء الكبد والكليه والطحال وجد ان الانزيم ياثر تاثيرا كبيرا في نسيج الكبد حيث سبب تنكس في الخلايا الكبدية مع تجمع للمواد الدهنية في الخلايا الكبدية ,تنخر , ارتشاح الخلايا الالتهابية , التهاب المنطقه البوابية , احتقان للاوعية الدموية وتكون خراجات في النسيج البرنكيمي وحدوث تليف حول هذه الخراجات. بينما التاثيرات في نسيج الكلى تمثلت بتنكس في الخلايا الكلوية , تنخر في نبيبات الكلية , ارتشاح الخلايا الالتهابية , وذمة وتجمع للسوائل ,وخراجات واحتقان الاوعية الدموية اما التاثيرات في نسيج الطحال فكانت اقل مقارنة مع الاعضاء الاخرى حيث سبب الانزيم توسع في اللب الابيض للطحال مع تنكس وتنخر بسيط في النسيج البرنكيمي | One hundred sixty two isolates of urine and wound specimens were collected from patients of both sex from September 2009 to February 2010. These isolates were identified according to morphological and biochemical tests, 55 isolates were found belong to genus Proteus with isolation percentage 33.9%. 5 isolates of P.vulgaris were obtained after using ApI 20E system which represent the isolation percentage 9.09% of total isolates. The ability of these isolates to produce lecithinase enzyme by using agar well diffusion method was determined, only 4 isolates of P. vulgaris produce this enzyme which appear as opaque zone around colonies on egg yolk agar, P. vulgaris P(1) was the best isolate for lecithiunase production.The lecithinase P. vulgaris P(1) strain was extracted and purified by precipitation with 60% saturation of ammonium sulfate, dialysis and gel filtration with Sephacryl S 200 column, two peaks of protein appeared in last step, the lecithinase activity was observed in second peak. The purified lecithinase has specific activity 217 unit/mg with protein concentration 0.29 mg/ml.P. vulgaris lecithinase was treated with different antibiotics to determine their effect on the production and activity of this enzyme, the antibiotics varied in their effect, some of them prevent production such as amoxillin/Clavulanic acid , erythromycin and gentamycin at 64, 256 and 8 µg/ml respectively, while benzathin penicillin and rifampin did not effect on the production of enzyme, but only rifampin was decreased lecithinase activity at 128 µg/ml. The LD50 and KID50 of partial pure enzyme was determined in mice and it was 210, 82.5µg/ml respectively. Histopathological effect of partial pure lecithinase was studied. It was found that the lecithinase was more effective on liver tissue than kidney tissue which caused sever degenerative changes of hepatocyte cells with accumulation of lipid materials (fatty change), necrosis, infiltration of inflammatory cell, inflammation of portal area, congestion of blood vessel, abscess formation in liver parenchyma and fibrosis around the abscess. while the effect of lecithinase on kidney showed degenerative of kidney cell, necrosis of renal tubule, with inflammatory cell infiltration, edema, abscess and congestion of blood vessel in kidney. Finally, less effect revealed by lecithinase on spleen tissue, which caused enlargement of white pulp forming germinal center with slight degenerative change and mild necrosis of parenchymal tissue
