انتاج الليفان من البكتريا المعزولة من تربة الجذور وتقييم العوامل المؤثرة على انتاجه == Levan Production by Bacteria Isolated from Rhizosphere Soil and Evaluation of Factors Affecting its Production
Author name:
سناء بشير كاظم
Supervisor name:
صفاء الدين احمد شنتر القيسي
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
University of Baghdad
Language:
English
University location:
Baghdad
First pages:
24T3336 - p.pdf
Abstract:
تعتبر منطقة التربة المحيطة بالجذور مصدرا مهما للعديد من الاحياء المجهرية مثل الفطريات والبكتريا والبكتريا الخيطية. في الدراسة الحالية، تم عزل البكتريا المنتجة لليفان من التربة المحيطة بالجذور. حيث تم الحصول على 15 عينة من التربة المحيطة بجذور البقوليات ( الباقلاء واللوبيا ) خلال الفترة بين تشرين الاول 2014 الى كانون الثاني 2015، من ثلاث مزارع للبقوليات في ناحية كنعان، محافظة ديالى. تم عزل 52 عزله من بكتريا الجذور (الرايزوسفير) واختبرت لمعرفة قابليتها لانتاج الليفان وذلك بالاعتماد على نمو المستعمرات المخاطية عند تنمية هذه البكتريا على وسط الاكار المغذي الحاوي على السكروز. وقد اظهرت النتائج مقدرة 36 عزلة بكتيرية جذرية على انتاج الليفان من المجموع الكلي للعزلات. شخصت العزلات الاربع الاكثر كفاءة لانتاج الليفان ووصفت بواسطة الفحوصات المظهرية والبايوكيميائية القياسية والاختبارات على المستوى الجزيئي. تم اجراء التشخيص الجزيئي لهذه العزلات الاربعة باستخدام 16S rDNA والتي اظهرت ان طول تسلسل المنطقة كان (946، 1056، 1064و1154) زوجا قاعديا للعزلات (2، 3، 23 و33) على التوالي. ان محاذات التسلسل في بنك الجينات اظهر ان العزلات الاكثر كفاءة كان لديها نسبة عالية من التشابه (98، 96، 98 و99) % على التوالي وتبعا لاقرب جار تطوري لهذه العزلات, تم التعرف عليها تبعا لتتابع جين (16S rRNA) وتبعا للفحوصات الشكلية والكيموحيوية , وشخصت على انها (Brachybacterium phenoliresistens، Elizabethkingia anophelis، Arthrobacter globiformis، Pseudomonas brassicacearum) على التوالي. تم تشخيص الليفان المنتج من هذه العزلات الاربعة باستخدام تقنية TLC والتي اظهرت تكون الليفان من نوع واحد من السكريات الا وهو الفركتوز. وقد تم تشخيص الليفان المنتج بواسطة بكتريا B. phenoliresistens باستخدام تقنيتي FTIR وتقنية الرنين المغناطيسي النووي NMR. تحليل الليفان بواسطة هاتين التقنيتين اثبتت انتاج الليفان بواسطة هذه العزلة. تم دراسة تاثير العوامل الغذائية والفيزيائية على انتاج الليفان بواسطة العزلات الاكفا. كان مصدر الكاربون الامثل لانتاج الليفان بواسطة هذه العزلات هو السكروز، حيث كان انتاج هذه العزلات هو 7.88، 7.94، 7.8 و7.77 غم/لتر للعزلات B. phenoliresistens، E. anophelis، A. globiformis ، P. brassicacearum على التوالي. تم استخدام اربع مصادر مختلفة للنايتروجين لمعرفة افضل مصدر نيتروجيني لانتاج الليفان. حيث كان الكازائين هو افضل مصادر النيتروجين لانتاج الليفان حيث كان انتاج هذه العزلات 8.12، 8.2، 8.24 و8.56 غم/لتر للعينات الاربعة على التوالي. تم استخدام تراكيز مختلفة للسكروز لانتاج الليفان حيث كان اعلى انتاج لجميع العزلات عند التركيز 300غم/لتر وكان الانتاج بواسطة هذه العزلات 7.97، 7.94، 8.06 و7.95 غم/لتر على التوالي. تم استخدام قيم pH مختلفة لمعرفة افضل اس هيدروجيني لانتاج الليفان حيث كان افضل اس هيدروجيني هو 7.8 لكل العزلات، وكان الانتاج 7.88، 7.94، 7.8، 7.77 غم/لتر على التوالي. فضلا عن ذلك، تم اختبار عدة ظروف مثل فترة الحضن المثلى، درجة الحرارة، معدل الرج. كانت فترة الحضن المثلى للعزلة E. anophelis 48 ساعة حيث انتجت 8.46غم/لتر، في حين كانت 72 ساعة لباقي العزلات حيث انتجت 8.58، 8.53 و8.7 غم/لتر للعزلات B. phenoliresistens ، A. globiformis وP. brassicacearumعلى التوالي. درجة الحرارة المثلى لانتاج الليفان بواسطة العزلة B. phenoliresistens كانت عند 30 درجة مئوية حيث انتجت 7.87 غم/لتر، وكانت درجة الحرارة المثلى هي 33 درجة مئوية للعزلتين E. anophelis وA. globiformisحيث انتجت عندها 8.04 و8.6 غم/لتر على التوالي. في حين كانت درجة الحرارة المثلى للعزلة P. brassicacearum 40 درجة مئوية وكان انتاجها 8.24 غم/لتر. استخدمت ثلاث معدلات رج لمعرفة افضل معدل رج لانتاج الليفان. تم الحصول على اعلى انتاج لليفان عند معدل رج 150 هزه/دقيقه، حيث كان الانتاج للعزلات B. phenoliresistens، E. anophelis وA. globiformis هو 8.12، 8.54 و8.27 غم/لتر على التوالي. | The Rhizosphere zone is a narrow volume of soil which surrounds the plants roots and influenced by the activity and growth of the root. In the present study, Levan producing bacteria were isolated from rhizosphere soil, fifteen rhizosphere soil samples were obtained from the legumes roots cowpea and broad bean (Vinga unguiculata L. and Vicia faba) during the period from October 2014 to January 2015, which were collected from three legumes farms in Kana’an Village, Diyala Governorate. A total of 52 Rhizobacterial colonies were isolated, purified and screened for their ability to produce levan, depending on growing of mucoid colonies on sucrose nutrient agar. The results showed that thirty six isolates out of the total number of the isolates were identified as levan producers. The most efficient four isolates were identified and characterized according to standard biochemical and Molecular tests. The Molecular identification of these four isolates was carried out by using 16S rDNA, which resulted in sequenced region of 946, 1056, 1064 and 1154 base pair in length respectively. The sequence alignment in the gene bank indicated that the most efficient isolates (2, 3, 23 and 33) have high percentage of similarity (98, 96, 98 and 99 % respectively), in comparison with the retrieved consensus sequences. The closest phylogenetic neighbor for these isolates is predicted according to the 16S rRNA gene sequence, morphological and biochemical tests. These isolates were identified as (Brachybacterium phenoliresistens, Elizabethkingia anophelis, Arthrobacter globiformis and Pseudomonas brassicacearum) respectively. Levan production by these four isolates were characterized by using Thin Layer chromatography (TLC) technique, which revealed that levan is composed of only one sugar which is fructose. Levan produced by B. phenoliresistens was characterized by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy techniques. The instrumental analysis indicated that Levan was produced by the selected isolate. The effect of some nutritional and physical factors were investigated on levan production by the highest four isolates. Sucrose was the best carbon source for levan production in all isolates that gave (7.88, 7.94, 7.8 and 7.77) g/l by B. phenoliresistens, E. anophelis, A. globiformis and P. brassicacearum respectively. In addition, four nitrogen sources were used to identify the best nitrogen source for levan production. Casein was the best nitrogen source for all isolates that gave (8.12, 8.20, 8.24 and 8.56) g/l by B. phenoliresistens, E. anophelis, A. globiformis and P. brassicacearum respectively,. Moreover, different sucrose concentrations were used to assess the best concentration for levan production. The highest levan yield by all isolates was at the sucrose concentration of 300 g/l, which gave (7.97, 7.94, 8.06 and 7.95) g/l respectively. Different pH values were also used to determine the best pH value for the levan production. The four isolates gave their highest levan production (7.88, 7.94, 7.80 and 7.77) g/l at pH 7.8. Further, conditions were examined like optimal incubation period, temperature and agitation rate. The optimal incubation period was 48 hs for E. anophelis that gave 8.46 g/l and 72 hs for B. phenoliresistens, A. globiformis and P. brassicacearum which gave (8.58, 8.53 and 8.7) g/l respectively. Whereas, the optimal temperature was 30ºC for B. phenoliresistens that produced 7.87 g/l , 33 ºC for E. anophelis and A. globiformis which gave (8.04 and 8.6) g/l, and 40 ºC for P. brassicacearum that gave 8.24 g/l. Three agitation rates were used to identify the best agitation rate for levan production. The highest levan production yield was obtained at 150 rpm by the isolates B. phenoliresistens, E. anophelis and A. globiformis which gave (8.12, 8.54 and 8.27) g/l respectively.
