تنقية وتوصيف انزيم اللايبيز المستخلص من بذور فول الصويا المنبتة واستخدامه كمحسن للخبز == PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF LIPASE EXTRACTED FROM SOY BEAN SEEDS AND USED IT AS IMPROVER IN BAKING
Author name:
بتول محمود محمد الانصاري
Supervisor name:
علي احمد ساهي | ضياء فالح الفكيكي
General topic:
Agricultural sciences
Specific topic:
Food
Degree:
Doctorate
University:
University Of Basrah - Faculty Of Agriculture
Language:
Arabic
University location:
Basrah
First pages:
31T1763 - p.pdf
Abstract:
تضمنت الدراسة استخلاص وتنقية انزيم اللايبيز من سبعة انواع من البذور الزيتية قبل وبعد الانبات وهي(فول الصويواالسلجم وزهرة الشمس والعصفر والدخن والذرة الصفراء والخروع). اظهرت نتائج تقدير الفعالية النوعية ان افضل نوع للبذور الزيتية هو بذور فول الصويا اذ اعطت اعلى فعالية نوعية للانزيم في البذور قبل الانبات وبعد الانبات 3.58 و11.20 وحدة / ملغم بروتين على التوالي مقارنة مع بقية الانواع الاخرى. استخلص اللايبيز من بذور فول الصويا قبل وبعد الانبات باستعمال تسعة محاليل استخلاص ووجد ان افضل محلول للاستخلاص هو محلول Tris - HCl تركيز 0.1 مولاري الحاوي على 0.01 مولاري كلوريد الكالسيوم و0.001 مولاري اثلين داي امين تترا استك اسد و0.001 مولاري كلوريد المغنسيوم وبدالة حامضية 8 , اذ انه اعطى اعلى فعالية نوعية. درس التركيب الكيميائي لبذور فول الصويا قبل الانبات وخلال مدة الانبات المختلفة اذ لوحظ ارتفاع نسبة البروتين في البذور المنبتة لتصل ذروتها عند نهاية اليوم الخامس من الانبات والذي بلغ 41.60% مقارنة بنسبة البروتين قبل الانبات 35.57 %. اما نسبة الدهن والكاربوهيدرات والرماد فقد انخفضت في البذور خلال مدد الانبات اذ بلغت 17.75 و30.18 و5.97 % على التوالي مقارنة بالبذور غير المنبتة 20.74 و32.5 و6.26 % على التوالي. تم متابعة تطور اللايبيز في مدة الانبات لبذور فول الصويا, اذ امتلك اعلى فعالية في اليوم الخامس من الانبات حيث بلغت 38.00 وحدة/ مل . اجريت خــــــــــــطوة الترسيب التدريجي للانزيم باستعــــــــمال نسب اشباع متدرجــــــــــــــــة من كبريتات الامونيوم 30 - 90 %, اذ لوحظ حدوث ارتفاع واضح بشكل تدريجي للفعالية النوعية للانزيم في الراسب الناتج لغاية نسبة اشباع 80 % وقد اعطت هذه الخطوة فعالية نوعية مقدارها 324.44 وحدة / ملغم بروتين وحصيلة انزيمية بلغت 29.20 % بعدد مرات تنقية مقدارها 10.78 مرة. اما خطوة التنقية بالترشيح الهلامي باستعمال عمود الترشيح الهلامي Sephadex G - 100فقد بلغت الفعالية النوعية 366.66 وحدة/ ملغم بروتين وبحصيلة انزيمية 17.83% وبعدد مرات تنقية 12.18 مرة. وبينت نتائج تحديد نقاوة اللايبيز ظهور حزمة بروتينية واحدة عند الترحيل الكهربائي في هلام متعدد الاكريلامايد بغياب العوامل الماسخة, في حين بلغ الوزن الجزيئي 41.687 كيلو دالتون بطريقة الترحيل الكهربائي في هلام متعدد الاكريلامايد بوجود العوامل الماسخة . وجد ان الدالة الحامضية المثلى لفعالية الانزيم كانت 8 , في حين تراوحت الدالة الحامضية المثلى لثبات الانزيم بين 7 - 9 اذ احتفظ الانزيم بـ 90 % من فعاليته. بينما لوحظ ان درجة الحرارة المثلى للفعالية الانزيمية للانزيم المنقى هي 40 م وان الانزيم يفقد 67 % من فعاليته على 90 م . اظهرت نتائج تاثير الايونات المعدنية والعوامل المختزلة والكلابية على فعالية اللايبيز ان لايونات الزئبقيك والخارصين والحديدوز بتركيزي 1 و5 ملي مولاري تاثير تثبيطي في فعالية الانزيم ،اذ بلغت الفعالية المتبقية 63.2 و68.9 و66.1 % على التوالي, في حين احتفظ الانزيم بكامل فعاليته عند تركيز 5 ملي مولاري بوجود ايونات الكالسيوم والبوتاسيوم. كمااظهرت العوامل الكلابية والمختزلة ان للـ EDTA دورا تنشيطيا عند حضنه مع اللايبيز بتركيز 1 و5 ملي مولاري. ولوحظ ان اللايبيز لا ينتمي الى مجموعة الانزيمات الفلزية (metalloenzyme). اما اليوريا فكان لها دور تثبيطي على فعالية الانزيم عند تركيز1 و5 ملي مولاري, في حين بلغت الفعالية المتبقية للانزيم 86.2 % عند حضنه مع 1% Mercaptoethanol 2 - , بينما كانت الفعالية المتبقية للانزيم عند حضنه مع Hydrogen peroxide وSodium hypochlorid 74.7 و75.8 % على التوالي بتركيز1 % .ولوحظ ان لمواد الشد السطحي تاثيروااضحا على فعالية الانزيم عند تركيز 1 و5 %, اذ احتفظ الانزيم بكامل فعاليته عند حضنه مع Triton X - 100 وTween 20عند تركيز 1% . في حين تاثرت فعالية اللايبيز باضافة المنظفات التجارية, ولكنها اظهرت ثباتية عالية في وجود المنظف Sar حيث بلغت الفعالية المتبقة 99.1 %. بينت النتائج تباين النسبة المئوية للاحماض الامينية الموجودة في اللايبيز اذ لوحظ ان اعلى تركيز كان لليوسين Leu بلغ 16.4 % بينما اقل تركيز كان للاسبارتك ASP 1.5 % في حين تفاوتت الاحماض الامينية الاخرى في نسبها المئوية. اظهرت نتائج فحص الفارينوغراف وجود فروق معنوية بين قيم متوسطات نسب امتصاص الماء للمعاملات واظهر تركيز 0.004 ملغم لايبيز / 100 غم طحين و0.75 % محسن Ovalette اعلى نسبة امتصاص للماء 61.7 و59.9 % على التوالي , في حين ازدادت فترة الاستقرار معنويا 9.6 و9.9 دقيقة عند تركيز 0.002 و0.004 ملغم لايبيز/ 100 غم طحين و13.3 و11.6 دقيقة عند تركيز0.50 و0.75 % محسن. اما قيم متوسطات فترة النضج للعجين فقد ازدادت مع زيادة تركيز الانزيم 0.002 و0.004 ملغم لايبيز/ 100 غم طحين معنويا اذ كانت 7.2 دقيقة وارتفعت فترة نضج العجين عند جميع تراكيز المحسن 6.8 و8.5 و6.2 دقيقة على التوالي مقارنة مع العجين الخالي من اية اضافة. وجد من العلامات النهائية للتقويم الحسي ان افضل معاملة كانت عند اضافة اللايبيز بتركيز 0.002 ملغم لايبيز/ 100 غم طحين و0.5 % Ovalette وكان المجموع النهائي للمعاملات 95 و94 % على التوالي. لوحظ من نتائج فحوصات تاثير اللايبيز على تجلد الخبز ان قيم كل من حجم الراسب في عالق اللب المائي وقوة التشرب ورطوبة اللب انخفضت تدريجيا مع زيادة مدة حفظ الخبز, اما نسبة الرطوبة في القشرة فقد ازدادت مع تقدم مدة الحفظ. وكان تاثير اضافة اللايبيز والمحسن Ovalette ايجابيا على الصفات النوعية ( الحجم ولون ونضارة اللب) والخزنية (تاخر تجلد اللب) للخبز المختبري | The study included extraction and purification of lipase enzyme from seven kinds of oil seeds before and after germination, those were (soy bean ,rapeseed, sunflower, safflower, pearl millet, yellow corn and castor bean seeds). The results of spcific activity estimation showed that , the best kind of oil seeds are soy bean seeds, they gave the highest specific activity of enzyme before and after germination 3.58 and 11.20 unit/ mg protein respectively comparing with other varieties. Lipase was extraction from soy bean seeds before and after germination using nine extraction solutions the best extractant solution was Tris - HCl 0.10 M containing 0.01M calcium chloride and 0.001mM ethylene di amin tetra acetic acid and 0.001 mM magnesium chloride pH 8. Lipase improvement was monitored through the germination period of soy bean seeds, it reached the highest activity of lipase after five days of germination ,which was 38.00 unit / ml .The chemical composition of soy bean seeds studied before germination period and through different germination period , higher protein percentage was noticed in the germination seeds where it reached its peak at the end of five days of germination 41.60 % compared with protein percentage before germination 35.57 %. For the percentage of fat, charbohydrates and ash they decreased in the seed through germination periods, down to 17.75 %, 30.18 % and 5.97% respectively compared with non - germinated 20.74 % and 32.50 and 6.26% respectively. The gradually precipitated by addition of ammonium sulphate to final saturation of 30 - 90%. Agradual obvious higher specific activity of the enzyme in the precipitate resulted ,till saturation level 80% , this step gave aspecific activity of 324.40 unit/ mg protein and an enzyme yield of 29.20% ,purification folds 10.79 time. While purification step of gel filteration using Sephadex G - 100 where the specific activity 366.66 Unit / mg protein , enzyme yield of 17.83 % and purification fold 12.18. Results for determination of lipase purity showed an appearance of a single protein band by poly acrylamide gel electrophoresis with out of denaturizing agent . The molecular weight of enzyme was 41.687 kilo dalton by poly acrylamide gel electrophoresis with denaturizing agent . The optimum pH for enzymtic activity of the purified enzyme were 8 while the optimum pH stability profile of the enzyme was between 7 - 9, and the enzyme kept 90% of its activity, while notes that the optimum temperature for the enzymatic activity of the purified enzyme was 40 C ͦ, and that enzyme loses 67% of its activity at 90 C ͦ. The resulte of effectness of metal ions and reducing and chelating agent was showed that ions of mercury and zinc ions and ferrous at concentrations of ( 1 and 5 ) m M have an inhibition effect on enzyme activity, as the remaining activity reached the values 63.2 .68.9 and 66.1% respectively , while the enzyme kept its total activity at concentration of 5 m M in the presence of calcium and potassium ions. The chelating and reducing agents showed that EDTA has an active rule when the enzyme incubated with 1 and 5 mM of lipase. And it was noticed that lipase dosn΄t belong to the metalloenzyme group. For urea , it has an active rule on the enzyme activity at 1 and 5 M ,where remaining activity for the enzyme reached 86.2% when incubated with 1% 2 - mercaptoethanol while it was 74.7 and 75.8 % respectivly when incubate with 1% of Hydrogen peroxide and Sodium hydrochloride respectively. Concentration ,for enzyme kept its total activity when incubated with Triton X - 100 and Tween 20 at concentration 1%. While lipase activity did n΄t effected by adding commercial detergents, it also showed a high stability in present of Sar detergent where as residual activity reached 99.1 % . Results cleared the contrast of amino acids existin lipase because it is noticed that the highest concentration reached by leucine was 16.4% where as lowest concentration was that reached by aspartic acid 1.5% ,the other amino acids differed in their percentage . The results of pharinograph test showed that there were significant differences between the mean of water absorption the ratios showed that the concentration of 0.004 mg / 100 g flour of enzyme and 0.75% improver give highest absorption of water with significant of moral 61.7 and 59.9% respectively, while the stability period increased to 9.6 and 9.9 minutes at a concentration of 0.002 to 0.004 mg / 100 g flour of enzyme and 13.3 and 11.6 minutes at a concentration of 0.50 and 0.75% improver with significant differences. The average values of maturity period of the dough increased with increasing concentration of the enzyme 0.002 and 0.004 mg / 100 g flour with significant difference as it was 7.2 minutes and increased the maturity period of the dough at all improver concentrations of 6.8, 8.5 and 6.2, respectively, compared with the dough without any addition. Found from the final marks of sensory evaluation ,it is found that the best process was when add lipase at 0.002 mg / 100 g flour concentration and 0.5 % Ovallete ,the final marks were 95 and 94 % respectively. Its has been noticed that the values of volume of sediment in the crumb aquous suspended ,absorption power and crumb moisture, all reduced gradually with the increasing of loaf storage time. While the moisture content of crust was increased The effect of adding enzyme and improver Ovallete was positive regarding the specific characteristics of loaf such as ( volume ,color and softness of crumb) for loaf.
